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CMVpromoterとインサートの間の配列 トピック削除
No.11417-TOPIC - 2023/04/29 (土) 18:56:52 - Li
疑問点がありましてこちらで質問させてください。

MCS内に挿入したインサートを、CMVプロモーターで発現させるプラスミドを自作したいと考えております。(下記のイメージです)

---(CMVpromoter)----(インサート)-----

上記でCMVプロモ開けるものなのでしょうか？
また、この間ーターもマニュアルで組み込む必要がある場合、CMVとインサートの間は何bpほどの配列は決まった配列があったりするのでしょうか？
　
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(無題) 削除/引用
No.11417-7 - 2023/05/01 (月) 08:52:00 - ---
TATAボックスと翻訳は関係があるのだろうか？

(無題) 削除/引用
No.11417-6 - 2023/04/30 (日) 20:36:03 - Li
2MEさん、おおさん、返信ありがとうございます。

とりあえず、UTRを入れて試してみます。
勉強になります、ありがとうございます。

おおさんの言う様に、いろいろなベクターが出回っているので、研究してみます。
ありがとうございます。

(無題) 削除/引用
No.11417-5 - 2023/04/30 (日) 11:31:54 - おお
世の中に出回っていてよく使われているベクターを調べてみたらいいのでは？

(無題) 削除/引用
No.11417-4 - 2023/04/30 (日) 03:30:21 - 2ME
> 30ヌクレオチドほど距離をあけるために、TATAボックスや、コザック配列以外の部分の配列は特にどのような配列でも大丈夫でしょうか？

それはあなたが決めることです。
もし何も考えずに、とりあえず実験を始めたいのであれば、目的遺伝子の5'UTRの配列を用いればよろしいのではないでしょうか。ただしその5'UTR配列があなたの実験目的に対してどのような影響をもたらすかは何とも申し上げようがありません。ついでに言えば先に挙げた30ntという数字に特に根拠はありません。悪しからず。

> また、プロモーターとインサートの間に、キメライントロン配列等の翻訳促進領を挟む場合、「プロモーターと翻訳促進領」、「翻訳促進領とインサート」の間もそれぞれある程度距離を離す必要があるのでしょうか。

スプライシングのコンセンサス配列が保持されるならば、差し当たりよろしいのではないでしょうか。他の「翻訳促進配列」に関しても同様です。

その種の質問はこの掲示板でしばしば話題に上がっているので、検索してみてはいかがでしょうか。

(無題) 削除/引用
No.11417-3 - 2023/04/30 (日) 02:37:48 - Li
2MEさん、ご返信ありがとうございます。

重ねて質問させてください。

＞しかしおそらくは、30ヌクレオチドくらいの距離を空けたほうがいいと思います
30ヌクレオチドほど距離をあけるために、TATAボックスや、コザック配列以外の部分の配列は特にどのような配列でも大丈夫でしょうか？

また、プロモーターとインサートの間に、キメライントロン配列等の翻訳促進領を挟む場合、「プロモーターと翻訳促進領」、「翻訳促進領とインサート」の間もそれぞれある程度距離を離す必要があるのでしょうか。

どうぞよろしくお願いいたします。

(無題) 削除/引用
No.11417-2 - 2023/04/29 (土) 21:03:20 - 2ME
経験上、CMVプロモーターと目的遺伝子のコザックATGを直接繋げたものを使って培養細胞において発現を確認したことはあります（これはCMVプロモーターのTATAボックスからコザックATGまで10ヌクレオチドぐらいだったろうか）。しかしおそらくは、30ヌクレオチドくらいの距離を空けたほうがいいと思います。
In our experience, we have confirmed expression in cultured cells using a construct that directly connects the CMV promoter to the Kozak-ATG of the gene of interest; this was probably about 10 nucleotides from the TATA box to the Kozak-ATG. However, it is likely better to leave a distance of around 30 nucleotides.

CMVpromoterとインサートの間の配列 削除/引用
No.11417-1 - 2023/04/29 (土) 18:56:52 - Li
疑問点がありましてこちらで質問させてください。

MCS内に挿入したインサートを、CMVプロモーターで発現させるプラスミドを自作したいと考えております。(下記のイメージです)

---(CMVpromoter)----(インサート)-----

上記でCMVプロモ開けるものなのでしょうか？
また、この間ーターもマニュアルで組み込む必要がある場合、CMVとインサートの間は何bpほどの配列は決まった配列があったりするのでしょうか？
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