BioTechnicalフォーラム [プラスミドが発現しなくなった]

プラスミドが発現しなくなった

No.11412-TOPIC - 2023/04/28 (金) 20:16:54 - 7878

お世話になっております。pBApo-CMVを使用し、Huh7やHepG2などに発現させていましたが、1ヶ月ほど前から急にまったく発現しなくなってしまいました。
いろいろと検討していますが、解決の糸口がなく困っております。

1　GFPは問題なく確認できているので、トランスフェクションには問題はなさそう
2　トランスフォーメーションを繰り返したことが問題かとおもい、発現が問題なかった時期のストックを増やして使用してもだめ
3　発現の確認は、ひとまずは外注の検査で行っている。
4　血清のロットは同じ
5　泳動、制限酵素カットは問題なし

シークエンスもしてみたほうがよいですよね。。

何かほかに検討すべき項目はありますでしょうか。すっかり実験が止まってしまい、だんだん落ち込んできました。何かアドバイスをいただければ大変ありがたいです。
　

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No.11412-7 - 2023/04/30 (日) 20:31:17 - 7878

>[Re:6] おおさんは書きました :

> 多少なりとも混じり物が生じるわけです(変異したものとか、もしかしたらコンタミとか)。その混じり物が、本来必要なプラスミドより増殖に有利だったら徐々にそっちに置き換わっていきます。ちゃんとコロニーから増やしていれば、普通は混じり物がなんか引く確率はほぼないだろうし、なんなら保険として2個拾っておけば十分。グリセロールストックなんかも同様で、こちらの方が極端に変になる。
>
> 配列を読むのはやってもいいけど、微妙なプラスミドのバリエーションが増えているなら、配列でーたは平均化されて変化がないように見えるかもしれない。

おおさん様
良く分かりました。ありがとうございます。
クローニングしたてだったころのプラスミドが残っているので、そちらを使用してみます。
なんだかうまくいく予感がします。

(無題)

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No.11412-6 - 2023/04/30 (日) 03:00:33 - おお

>[Re:4] 7878さんは書きました :
> >[Re:3] おおさんは書きました :
> > ちゃんとシングルクローン拾ってから、カルチャーしてますか？
>
> ありがとうございます！そこは思い当たる節しかないです。
> もしよろしければ、なぜか教えていただけませんか？
> プラスミドを増やすだけの時は全部一緒だと思い、適当にしてしまっていました。
>
>

多少なりとも混じり物が生じるわけです(変異したものとか、もしかしたらコンタミとか)。その混じり物が、本来必要なプラスミドより増殖に有利だったら徐々にそっちに置き換わっていきます。ちゃんとコロニーから増やしていれば、普通は混じり物がなんか引く確率はほぼないだろうし、なんなら保険として2個拾っておけば十分。グリセロールストックなんかも同様で、こちらの方が極端に変になる。

配列を読むのはやってもいいけど、微妙なプラスミドのバリエーションが増えているなら、配列でーたは平均化されて変化がないように見えるかもしれない。

(無題)

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No.11412-5 - 2023/04/29 (土) 17:33:06 - 7878

>[Re:2] 2MEさんは書きました :
> > シークエンスもしてみたほうがよいですよね。。
>
> ですね。

ありがとうございます！週明け予定します。

(無題)

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No.11412-4 - 2023/04/29 (土) 17:31:12 - 7878

>[Re:3] おおさんは書きました :
> ちゃんとシングルクローン拾ってから、カルチャーしてますか？

ありがとうございます！そこは思い当たる節しかないです。
もしよろしければ、なぜか教えていただけませんか？
プラスミドを増やすだけの時は全部一緒だと思い、適当にしてしまっていました。

(無題)

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No.11412-3 - 2023/04/29 (土) 16:55:56 - おお

ちゃんとシングルクローン拾ってから、カルチャーしてますか？