BioTechnicalフォーラム [大腸菌を用いたプラスミド調製]

大腸菌を用いたプラスミド調製

No.11402-TOPIC - 2023/04/25 (火) 15:01:53 - プラスミド

プラスミドDNAの大腸菌を用いた大量調製の実験を行なっております。
プラスミドをDH5aなどの大腸菌に形質転換し、同一コロニーを滅菌水で懸濁し、複数の試験管の培地に植菌し、培養した後、プラスミド抽出を行なった結果、最終的な濃度が2倍程度違うサンプルがありました。
みなさまは、経験上このようなことがありますか。
　

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No.11402-8 - 2023/04/26 (水) 18:18:02 - G25

集菌したときに沈殿の量はどうでしたか。バラつきありませんでしたか。
もしプラスミドの収量に倍近いばらつきがあったなら、菌体量が最初から違っていた、つまり培養が均質でなかったと思います。

もし、菌体量にバラつきがなかったとしたら、同一クローンなのに細胞あたりのコピー数がそんなにばらつくはずもなく、おそらく抽出操作の手ブレみたいなものじゃないかな。

経験上、同じ宿主ベクター系ならクローンが違っても収量（プラスミド重量換算）はかなりコンスタントなんですけど（インサートサイズが違っても重量で見ると同じくらい取れてるので、大きいプラスミドは実はコピー数が少なくなっているのかもしれないけど）。

あと定量が正しいかどうかの問題もある。吸光度では干渉要因がいろいろあるので、サンプル毎に多め少なめの見積もりになることはありがち。
電気泳動像でみてバンド強度もそのようにばらついているだろうか。

(無題)

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No.11402-7 - 2023/04/26 (水) 01:05:31 - おお

経験的にそんなに収量がコンシスタントとういうわけでもなさそうです。
全ての試験管が全く同じ環境になっているかいうと、ちょっとした傾きの違いなど、目では明らかに確認できないれべるでも影響があるかもしれないし、逆にいうと、完璧に一緒の環境が作れるのかという事、外気のあたり方も場所によって変わるかもしれないし。

抽出方法もちょっとしたことで効率がぶれそうな気もする。

(無題)

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No.11402-6 - 2023/04/25 (火) 22:47:29 - α

別の変異入れたコロニーで同じくらいの菌量で
収量バラつくのはよくあるし
同じコロニーなら同時に精製して
片方1000ng/uLで片方10はあまりないにしろ
1000＞500で2倍　2000＞1000で2倍くらいは差がでても
おかしくはないんじゃない
水で均一化しても別の試験管に分けた時点で
まったく同じものじゃないわけだし。
精製の順番でも差はあるし。

TFしたプレートなら1㎜以下で数百個生えてそうだけど
前日にプレート全体に撒いてるから突き方によっちゃ
シングルに見えて重なってたとかもありそう
そっからさらに引いたコロニーならともかく。

(無題)

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No.11402-5 - 2023/04/25 (火) 17:58:56 - のなめ

手技的なものもあると思います。
プラスミド抽出の時のバッファーへの懸濁が甘かった、solution2、3を入れるときのチューブごとの時間差などいろいろファクターはあります。

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No.11402-4 - 2023/04/25 (火) 17:00:44 - TS

>同一コロニーを滅菌水で懸濁し、複数の試験管の培地に植菌し、培養

これはやったことないけど、普通にシングルコロニーを拾って、培養したときに2倍くらい違いがでることはなくもない。

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No.11402-3 - 2023/04/25 (火) 15:36:41 - momo

試験管の培地に植菌して培養しているのに大量調製なのですか？それとも試験管で培養した後に大量の培地に植え替えているのですか？後者だとしたら、培養の途中にプラスミドが落ちたのがstochasticに起こっているのだと思います。