BioTechnicalフォーラム [フェノクロの作り方とNucleaseフリー水について]

フェノクロの作り方とNucleaseフリー水について

No.11396-TOPIC - 2023/04/23 (日) 13:34:09 - あ

DNAを扱う実験が初めてなのですが、フェノール/クロロホルムの作り方がわかりません。
膜タンパク作成のKitでプラスミドDNAの高純度調整に使うようで、フェノール：クロロホルム：イソアミルアルコールを25:24:1のpH7.9のようですが、どのように混ぜればよいのでしょうか？
現在手元にあるのが、和光特級の粉末フェノール(核酸用でなくても大丈夫でしょうか？)、クロロホルムとイソアミルアルコールです。
調べるとフェノールは中性平衡？したものを用いるとあり、上層と下層に分かれて上層を使うなどと記載されてましたが、有機溶媒を調整するのが初めてでどれくらいの量のフェノールを何の液体の何mlに溶かせばいいのかすらわかりません。後、有機溶媒や危ない試薬を調整する際にメスシリンダーを用いてよいのかどの容器で溶かせばいいのかも教えていただけませんか？

2つ目はNucleaseフリー水についてで、Kitに記載されているTEバッファーの調整はDEPC未処理のフリー水で行うようにありますが、miliQを滅菌したもので代用は駄目なのでしょうか？

よろしくお願いいたします。
　

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No.11396-11 - 2023/04/24 (月) 12:26:37 - G25

核酸グレード、分子生物学グレードと称して販売されているフェノールもありますが（価格が跳ね上がりますが）、普通の特級試薬で十分です。基本的にそういうグレードの製品は特級相当のグレードの試薬をヌクレアーゼ活性とか核酸精製に使ったとき各種酵素の阻害性なんかの検査をしてQCしているだけで、モノ自体がとくに品質が高いというわけじゃないです。で、たぶん検査で引っかかるようなロットがでることは無いんだろうと思います。前世紀に始まりこれまで随分とバッファ飽和フェノールを調製し使用してきましたが、ずっと特級を使ってきて、トラブルになったことはありません。

ちなみに、分子生物学黎明期にはいろいろ試薬の品質が良くなくて、フェノールなんかは不純物や酸化で着色しているようなのが普通だったそうで、自前で蒸留してから使っていたりしたらしい（さすがにその次代は経験していないけど、Molecular Cloningの初期の版にはそういった記載があった）。今でも保存が悪く古くなったバッファ飽和フェノールは酸価して品質が悪くなって着色したりするけど、市販品がそういう状態ということは皆無ですからね。

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No.11396-10 - 2023/04/24 (月) 09:30:34 - おお

フェノールなどを使ったDNAの抽出、精製法は核酸グレードの試薬が有る前から樹立されてますから、試薬特級で大抵の実験は十分です。また核酸グレードでないと起こる弊害みたいなものを具体的に聞いたこともありません。ただ、一応そう言うグレードのものがあるからそれを使うと言うなら、それでもいいでしょう。

作り方はしっかりと書かれたプロトコールを読んでください。危険物としての取り扱いなども意識するべきものなので。

DNAを扱うTEなどはミリQそのままで使えば殆どの実験でじゅうぶんです。

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No.11396-9 - 2023/04/24 (月) 03:47:09 - あの

DEPC とTrisの組み合わせがダメな理由や、
DEPCがRNA にダメージを与えることの簡潔な説明は
次などにあります

https://ja.wikipedia.org/wiki/%E3%82%B8%E3%82%A8%E3%83%81%E3%83%AB%E3%83%94%E3%83%AD%E3%82%AB%E3%83%BC%E3%83%9C%E3%83%8D%E3%83%BC%E3%83%88

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No.11396-8 - 2023/04/23 (日) 15:55:29 - G25

DEPC処理はオートクレーブでは失活できないRNaseを退治するためです。RNAを扱うときに考慮する処理です。DNaseはオートクレーブで失活するのでDNAワークではDEPC処理は必要ありません。

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No.11396-7 - 2023/04/23 (日) 15:51:18 - G25

成書をを見てください。
Molecular Cloningくらい、少なくともこの業界の研究室なり図書館なりアクセスできる範囲にあるでしょう。
「DNAの高純度精製に使うようで、」くらいの知識もないんだから、ちゃんと成書で学んだ方がいい。
生兵法はケガのもの。危険物でもありますか、実際事故で怪我することもよくありますから、ネット掲示板で聞いてすまそうなんて安直な姿勢では危なっかしい。

割高にはなるけど、調製済みのPCIを購入するのも悪くない。

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No.11396-6 - 2023/04/23 (日) 15:06:00 - あの

湯煎で溶かすときは、和光の試薬瓶の場合は、次のように
していました。忘却の彼方から引っ張ってきた記憶ですので、
抜けがあるかもしれませんが、メスシリンダーが不要です。

同様の褐色瓶をもう一本用意

フェノールが全部溶けたら、液面の高さに目印を書く。
溶けた液込みの重さを測る。

もう一本の褐色瓶に移して、そちらにも、目印を書く。

もとの瓶の重さを測って風袋重を調べる。

重さとして半分だけ、最初の褐色瓶に戻す。

溶けたフェノールを平衡処理(リンク先のように)

クロホとイソアミを、適量入れる。

以上の操作で、25:24:1が500ml入った褐色瓶が2本できる。

ただし、有機溶媒の使用や廃棄は所存施設の規定を確認すること。
それからDNA精製なら、他にも方法はあるので、
現在では、フェノクロイソアミはマイナーだと思う。

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No.11396-5 - 2023/04/23 (日) 14:46:14 - あの

数十年前に作った経験しかないので、忘却の彼方ですが、
確か、DNAなら、和光の特級ぐらいでもよかったように記憶しています。

調整法は、次のリンク先や、そのページからいけるリンク先見ればわかると
思いますが、ドラフト作業です。

http://life-science-project.com/1210/

追伸

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No.11396-4 - 2023/04/23 (日) 14:44:31 - ふみ

RNA実験でなくDNA実験なら、なおのことMilliQを滅菌せず使うのがよいです。

水

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No.11396-3 - 2023/04/23 (日) 14:43:11 - ふみ

RNA実験にMilliQを滅菌せずに使っています。
MilliQはオートクレーブしない方が綺麗だと思います。

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No.11396-2 - 2023/04/23 (日) 13:46:41 - zero

RNAでなくDNA実験であれば、MilliQ水で問題ありません。
RNAでもおそらく問題ないですけど。