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(無題) 削除/引用 No.11391-16 - 2023/04/22 (土) 16:34:22 - 大腸菌 G25様、おお様、回答ありがとうございます。 発現条件の検討は行なっておりますが、これまで改善は見られていません。 また、精製は行いましたが、目的タンパク質の回収は皆無でした。 そこで、発現条件の検討を引き続き行い、並行して、リフォールディングを試みているという流れです。リフォールディング条件の探索は非常に難しいことは承知しております。また、以前読んだ文献で夾雑タンパク質存在下だと、その効率が非常に落ちるということを見たので、先の質問をさせていただきました。

(無題) 削除/引用 No.11391-15 - 2023/04/22 (土) 15:31:59 - おお まず精製を考えないのが不思議でならないが、、、どのように構造を調べようとしているのかわからないけど、混じり物が有ればノイズも大きいはず。 リフォールディングもやれば必ずできるものでもないし。

(無題) 削除/引用 No.11391-14 - 2023/04/22 (土) 14:35:44 - G25 機能解析とは活性をみるとか？　構造解析とは　NMRなんかで構造を解くということでしょうか。 だとしたら正しくフォールディングしてないと上手くないですね。 第一に考えるべきは、封入体化せず可溶性で発現させること（宿主ベクター系や培養、発現条件の検討）じゃないでしょうか。それがうまくいかなかった時の次の手が封入体からのリフォールディング。私なら。

(無題) 削除/引用 No.11391-13 - 2023/04/22 (土) 12:55:27 - 大腸菌 G25様、回答・質問ありがとうございます。 取り合えずは、機能解析を行い、最終的には構造解析を行う予定です。

(無題) 削除/引用 No.11391-12 - 2023/04/22 (土) 12:34:47 - G25 精製したタンパク質を使う目的ななんでしょう。それによって、目指す精製度や精製方法は違って来るでしょう。 たとえばそこまでの必要もない目的なのに苦労して可溶化、refoldingするなら、うまい戦略とは言えないですよね。

(無題) 削除/引用 No.11391-11 - 2023/04/22 (土) 12:25:25 - G25 1%程度のTriton X-100, Nonidet-P40などの界面活性剤、あるいは適当な濃度の尿素を含んだバッファーで適当な回数、再懸濁、再沈殿する。 尿素は高濃度(8 Mなど)で封入体の可溶化に使われますが低濃度（例えば1 M）で、封入体を溶かさずに洗浄するのに使うこともできます（予備実験で効果的な濃度を決めるておくとなお良い）。 詳しくは成書を当たってください（ちなみに私のネタもとはMolecular Cloning 3rd ed. とAntibodies)。 不溶画分には封入体とは別の不溶性タンパクや膜といっしょに落ちて来る膜タンパク質などが混じっていて、そういうのを洗い落とすのでしょう。

(無題) 削除/引用 No.11391-10 - 2023/04/22 (土) 11:38:53 - 大腸菌 不溶性画分に目的タンパク質が発現した場合、ひとつの解決策としては、リフォールディングがありますが、今回のように夾雑タンパクが多い状態でも進めることは可能でしょうか。

(無題) 削除/引用 No.11391-9 - 2023/04/22 (土) 11:35:48 - 大腸菌 おお様、回答ありがとうございます。 破砕液、同量分から得られた可溶性画分あるいは不溶性画分を流しています。

(無題) 削除/引用 No.11391-8 - 2023/04/22 (土) 11:25:46 - おお >他タンパク質のバンドは上清画分よりはやや薄いですが、ほぼ同程度の濃さです。 これはどう解釈しているのですか？たとえば大腸菌を１ｍｌのLysis bufferで溶かし、遠心して不溶性のものを沈降させて不溶物を１ｍｌに溶かして比較したなら目的のたんぱく以外が若干薄いがほぼ同等というなら変だねって思うけど、不溶性のものを５０uｌに溶かして比較してほぼ同等なら不溶画分に来たものは全体の５％だけという話になると思う。仮に５０uｌに溶かしてこのような状態になる場合、１ｍｌに溶かせばバンドの強さは二十分の一でほとんど検出できな状況なら見た目組換えタンパク質だけが不溶性画分に行ったように見える。少なくともかなりエンリッチされたと思えるはず。

(無題) 削除/引用 No.11391-7 - 2023/04/22 (土) 09:44:48 - おお 疎水性の強い部分が露出したりする（大抵の場合ミスフォールディング）のがたんぱくが凝集して封入体の形成の一つの要因でしょうから、そういう疎水部が露出したものが他のたんぱく質に接近したなら、状況によってそのタンパクの疎水的な（たぶん表面に近い）部分が露出させられたりして封入体に巻き込まれたりもするでしょう。

(無題) 削除/引用 No.11391-6 - 2023/04/22 (土) 05:31:40 - 大腸菌 皆様、ご回答ありがとうございます。 G25さんがおっしゃっていることは、ごく簡単に申し上げると、封入体は目的のタンパク質に加えて、その他タンパク質も絡まって凝集しているということだと思いますが、一応、不溶性画分のWashは一度は行っております。「洗い」とは、どのような操作をしていますか？

(無題) 削除/引用 No.11391-5 - 2023/04/21 (金) 23:28:21 - 2ME 誤読してました。 大腸菌の不溶性画分にタンパク質があるのが普通です。

(無題) 削除/引用 No.11391-4 - 2023/04/21 (金) 21:58:57 - G25 それが普通です。 タンパク質が単純に不溶化するんじゃなくて、封入体(inclusion body)になってる訳で、 封入体ってそんなもの。 強制発現してできた封入体は80%以上あるいは90%以上が強制発現させたタンパク質からなるので、きれいに洗うだけで、そのまま免疫して抗体を作ることもできると教科書にも載ってます(Molecular Cloningなど)。逆にいうと10%から20%くらいは内在性のタンパク質も夾雑します。夾雑タンパク質が濃く見えているなら「洗い」が十分でないせいかもしれません。封入体の扱い方(洗い方、可溶化など)はMolecular Cloningほか、実験書に出てます。

(無題) 削除/引用 No.11391-3 - 2023/04/21 (金) 21:57:54 - qq 「培養した大腸菌を超音波破砕し、」が不十分だとしても、そのような結果になるでしょうから、超音波処理を弱めにではなく、強めにながくしてみるほうがいいんじゃなかろうか？ 抽出液にリゾリームやtritonX100などを入れて、大腸菌の溶解を促進してみるけど、市販の大腸菌抽出液を使っているのであれば、もう入っているのかな？

(無題) 削除/引用 No.11391-2 - 2023/04/21 (金) 21:47:50 - 2ME 電気泳動の問題として、サンプルアプライ時の隣接レーンへの漏れ。 発現系の問題として、GOIタンパク質のtruncated form、cleaved form、dimerization (polymerization）。 が考えられます。

組換えタンパク質のSDS-PAGEの結果 削除/引用 No.11391-1 - 2023/04/21 (金) 20:37:11 - 大腸菌 大腸菌を用いた組換えタンパク質発現の実験を行っております。 発現誘導し、培養した大腸菌を超音波破砕し、上清画分と不溶性画分をSDS-PAGEで流しました。すると、不溶性画分において組換えタンパク質のバンドが見られましたが、それに加えて、他のタンパク質のバンドもかなり見られました。他タンパク質のバンドは上清画分よりはやや薄いですが、ほぼ同程度の濃さです。これまで、あったとしても組換えタンパク質のみが不溶性画分に現れるものだと思っていました。この結果はどのように解釈すればよろしいでしょうか。ちなみに超音波破砕を弱め短めにしても同じような結果になりました。

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