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(無題) 削除/引用 No.11386-9 - 2023/04/25 (火) 13:53:51 - あああ かかります。 Crisprで遺伝子操作は楽になりましたが、その後のマウスの交配にすごく時間がかかることが昔から変わってしていません。世代時間か交配回数を減らす解決策があればいいのですが。。。 ＞やはりどんなに頑張っても1年弱はかかってしまうものでしょうか。 ＞コンディショナルはかなり時間がかかりますよね。

(無題) 削除/引用 No.11386-8 - 2023/04/25 (火) 10:24:23 - asan 一番いいのは既存のKOマウスを入手して使用するに限る。 自分で作る場合はCRISPRが第一選択でしょう。通常のKOを作る場合であってもindelによるcrisprKOはジェノタイプの難しさやflipなど変なものが生じるケースがあることもわかっているので、技術が確立した発生工学施設の併設している研究機関なら時間をかけられるならsmall deletionまたはdouble cutでエクソンを飛ばすようなやり方を勧められることも多いです。 また、コンディショナルやknock inについてもloxpを含むスモールオリゴをコトラしてやる方法で一発ですが、技術のない発生工学だと難しいので、B6 ESを用いてESレベルでCRISPRで作成してからマウスで選別するってやり方もあります。やり方によっても100％キメラに近い方法もあるので昔ほどESだからと時間がかかるわけでもありません。 もっとも、CRISPRならマイクロインジェクションじゃなくてエレクトロポレーションでたくさんできるので可能ならば、超過排卵体外受精で大量に処理する方法が一番早いんじゃないですかね。

(無題) 削除/引用 No.11386-7 - 2023/04/23 (日) 16:48:48 - のっく >[Re:6] AAさんは書きました : > >>CRISPRでKOマウスを作った場合、genotyping のプライマー > > 3'末端に変異部位が来るようにプライマーを設計すればやってやれないことはないです。(WT/KOの2種類のPCRをバラバラに行う) > > ただどうしても癖のあるPCRになり、人によって偽陽性偽陰性が出やすくなってしまうので、個人的には大きく欠損させたほうが良いのかなと思っています。 > 今はエクソンをいくつかまとめて飛ばすような改変でもすぐにいれられますので。 そうすると、単なるフレームシフトのCRISPRであれば、作成が簡単でも、維持がかなりストレスですよね。昔使っていたマウスのgenotyping PCRがバンドがでにくいことがあって。 CRISPRならエキソンごと飛ばすか、既成のマウスがいればどこかの施設から購入したほうが、長い目でみたら、労力がかなり違いそうですね。

(無題) 削除/引用 No.11386-6 - 2023/04/23 (日) 10:51:35 - AA >>CRISPRでKOマウスを作った場合、genotyping のプライマー 3'末端に変異部位が来るようにプライマーを設計すればやってやれないことはないです。(WT/KOの2種類のPCRをバラバラに行う) ただどうしても癖のあるPCRになり、人によって偽陽性偽陰性が出やすくなってしまうので、個人的には大きく欠損させたほうが良いのかなと思っています。 今はエクソンをいくつかまとめて飛ばすような改変でもすぐにいれられますので。

(無題) 削除/引用 No.11386-5 - 2023/04/23 (日) 07:25:44 - Cao やはりどんなに頑張っても1年弱はかかってしまうものでしょうか。 コンディショナルはかなり時間がかかりますよね。

(無題) 削除/引用 No.11386-4 - 2023/04/22 (土) 16:18:00 - のっく 私もちょっとKO マウスで聞いてみたいことがあったのですが、 CRISPRでKOマウスを作った場合、genotyping のプライマーはちゃんとできるものでしょうか？数塩基の違いをPCRだけで検出するのは、運次第なところがありそうです。もしくは生まれた個体はすべて、変異領域を毎回シークエンスするのでしょうか？

(無題) 削除/引用 No.11386-3 - 2023/04/21 (金) 10:22:04 - あああ KO-ESを購入せずに新しく作る前提で、 loxP-KOベクターを作ってESでターゲッティング、スクリーニング、ホモマウス樹立と、 受精卵にCrisprでKOコンストラクトを導入両方やりましたが、後者の方が楽ではありましたが時間はあまり変わりません。設備がなければ外注になると思いますので、手法よりもアカデミア価格が安いところで手打ちにするのがいいと思います。

(無題) 削除/引用 No.11386-2 - 2023/04/20 (木) 11:06:46 - AA 昨今ではノックアウトマウスコンソーシアムなど、網羅的にマウスを作っている団体などもあり、シンプルなKOマウスだと大体どの遺伝子についても、floxマウスについてもかなりの数の遺伝子について樹立済だと思います。 MGIなどのデータベースから簡単な表現型一覧も閲覧できますから少なくとも生存にかかわるような表現型かどうかはそこからわかると思います。 実際にお手元に導入するに際しては、樹立済みのものを入れるか自前で作るかは難しいところで、海外から入れる導入費用と国内でゲノム編集で作る費用はトントンくらいになっていると思います。 JAXなどに寄託されておらず海外の個別研究者に依頼するような場合は自前で作ったほうが早いこともよくあります。 単純なKOかconditional KOか、どちらが良いかはご自身の実験次第ですから内容とご相談ください。 そういったことを決めるのも研究者としての腕だと思います。

昨今KOマウスってどうやって作りますか。 削除/引用 No.11386-1 - 2023/04/20 (木) 10:21:36 - Cao 10年ほど前にある遺伝子の解析を行うために、KOマウスを作りましたが、昨今KOマウスってどうやって作るものなのでしょうか。Cas9の技術も導入されていいますが、作成手順も含めて、何がいいのか判断ができません。 前回とは異なり、KOマウスの表現型が予想できないのですが、最初から、conditionalにするのかしないのか、まずはオーソドックスにKOにするかでもだいぶ変わってくると思います。 どこから、何を購入するのか、購入しないのか、いろいろ考えることが多そうです。

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