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(無題) 削除/引用 No.11383-11 - 2023/04/24 (月) 08:41:35 - -- メチル化解析ならBisulfite seqはできる可能性はありそうですが、マウスを再度起こすというならそれを使えばいいですね。

(無題) 削除/引用 No.11383-10 - 2023/04/22 (土) 09:32:43 - NaOH おお様、G25様 ご返信ありがとうございます。G25様のおっしゃる通り、メチル化されていたらメチル化感受性制限酵素で切れないので、qPCRで制限酵素あり・なしを比べてメチル化率を計算します。切断が完全に行われていることは、メチル化感受性でないisoschizomerで確認します。 いくつか周りの人が持っているサンプルも含め比べてみたところ、 ・NaOH抽出ゲノム→メチル化感受性でない酵素でも、6時間切っても1/3程度切れ残っている（qPCRで計算）。逆に言うと2/3は二本鎖が残っていたということかと思いましたが、定量性という意味では、話になりませんでした。 ・NaOH抽出にフェノクロ→２サンプルしかしていませんが、上記と大差なし。 ・ProK処理されたゲノム（フェノクロなし）→メチル化感受性でない酵素はほぼ完全切断。qPCRの増幅効率はカラム精製したサンプルより悪いが、意外にも定量はできました（厳密にカラム抽出の時と値は比べられていませんが予想されたとおりの値ではあった） 今のところ、G25様のおっしゃる通りでNaOHでは少なくとも無視できないほどのDNAが一本鎖になっているだろうと考えました。 またご紹介頂いた論文の方法論は知らなかったのですが、これなら一本鎖でも使えそうですね。タンパク精製からしているようなのですぐに導入は難しそうですが、試してみたいです。ありがとうございます。 今回はコラボ先がと再度相談し、結局マウスを再度起こしたいそうなので、きれいなゲノムを準備してメチル化感受性酵素切断で処理することになりそうです。勉強になりました。ありがとうございました。

(無題) 削除/引用 No.11383-9 - 2023/04/21 (金) 19:02:07 - G25 その手の分野の方法論に明るくないのですが、 標的配列がメチル化されていれば制限酵素で切れずPCRがかかり、 メチル化されていなければ切れてPCRがかからない、 というような原理ですか？　 制限酵素消化ありなしでqPCRしてその比率からメチル化の割合を求めたりするのでしょうか。 NaOH処理制限酵素消化は無理なので、なにかそれに替わるアプローチがないかなあと考えていたんですが、 5-methylcytosine DNA glycosylaseなんか使えないですかね、 https://www.mdpi.com/1422-0067/22/3/1072

(無題) 削除/引用 No.11383-8 - 2023/04/21 (金) 01:11:46 - おお そういえばメチルシトシンに結合するタンパクでプルダウンするアッセイほうがありましたね。そのタンパクは２本鎖依存的なんだろうか。

(無題) 削除/引用 No.11383-7 - 2023/04/20 (木) 22:15:31 - NaOH おお様 早速ご提案ありがとうございます。おっしゃる通り有機溶媒を使いづらい環境なのですが、やはりフェノクロ処理を一度試してみます。飽和した尿素を使う方法はは知りませんでした。 G25様 おっしゃる通り厳しいかもしれません。ゲノムをメチル化感受性制限酵素で切断し、そこからPCR or qPCRをかけるというのが目的です（要はメチル化評価）。自分たちのラボは普段からカラムで精製したゲノムを使い、制限酵素処理〜PCRまでとして確立した系を持っているのですが、今回依頼されたコラボ先がNaOH抽出したゲノムしかもっておらず、マウスもいったん閉じてしまっていて新たに抽出できないが、何とか評価できないか、と言われて困っておりました。 全ゲノム増幅のご提案もありがとうございます。ただメチル化評価という意味では多分厳しいですよね・・

(無題) 削除/引用 No.11383-6 - 2023/04/20 (木) 09:00:49 - おお >[Re:5] G25さんは書きました : > そもそもNaOHで抽出したDNAは変性(一本鎖に解離)しているので制限酵素の基質にならないでしょう。 あ、その通りだ、、、

(無題) 削除/引用 No.11383-5 - 2023/04/20 (木) 07:18:45 - G25 そもそもNaOHで抽出したDNAは変性(一本鎖に解離)しているので制限酵素の基質にならないでしょう。 ゲノムDNAなんか一旦変性したらrenatureすることはほぼ不可能。 全ゲノム増幅 (WGA)をしたらいいかも。phi29 DNA polなどを使ったWGAのシステムがさまざまなメーカーから出ています。 なんのために制限酵素消化したいんでしょうか。そもそもそこから考え直す余地があるかも。

(無題) 削除/引用 No.11383-4 - 2023/04/20 (木) 04:58:39 - おお よく使われるプラスミドやPCRフラグメントなどの精製用カラムはゲノムのサイズを考えると難しいかもしれません。たとえば昔からあるカラムを使わない方法（LysateをPK処理してフェノール、クロロフォルム処理、エタチンのながれ）で５０ｋｂｐ平均サイズぐらい。出回っているプラスミド、PCRフラグメント用ではサイズがでかすぎます。ゲノム用に特化したキットなら精製できるかもしれません。

(無題) 削除/引用 No.11383-3 - 2023/04/20 (木) 02:00:42 - おお もともとPCRが目的なので、どの程度インタクトなDNAなのかは気になりますね。

(無題) 削除/引用 No.11383-2 - 2023/04/20 (木) 01:59:26 - おお 昔からある方法はフェノール、クロロフォルム処理で除タンパクする方法ですが、おそらく有機溶媒は使いたくないのかと思われます。 ちょっと変わったやり方としては、室温で飽和した尿素溶液を同量加えて、酢酸ナトリウムやNaCl（もしかしたらLiClがより良いかもしれません）とイソプロぱのーるで沈殿する方法。

NaOHで抽出されたゲノム 削除/引用 No.11383-1 - 2023/04/20 (木) 01:08:00 - NaOH お世話になります。 マウスのテールあるいは耳パンチの組織片からNaOH→95℃ボイル→TrisHCLで抽出されたゲノムDNA（を含むサンプル）から、purityの高いゲノムDNAを精製する方法はあるでしょうか？ ・他ラボのサンプルであるうえ、当該マウスで維持生存されている個体がないため、種々の組織等から抽出することは当面できません。 ・手元のNaOH処理されたサンプルをnanodropで測定すると、DNA濃度は100 ng/ul程度ですが、波形では当然タンパク質と思われる大きなピークがあり、260/280は1.2程度です。 ・Nanodropで約100ng/ulのNaOH抽出ゲノム40μlを使い、DNeasyカラムあるいはQIAquickカラムそれぞれのプロトコールに従って精製を試みましたが、カラムから溶出された収量はゼロでした。 ・再抽出したい理由は、NaOHゲノムの制限酵素処理の効率が著しく低いためです。 お知恵を拝借できますと幸いです。

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