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解決しました 削除/引用 No.11367-18 - 2023/05/08 (月) 13:34:59 - リード だいぶお時間たってしまいましたが、解決いたしました。 EDTA濃度を高めたこと、TritonX100の濃度を下げたことが鍵だったように思えます。 皆様、ありがとうございました！

(無題) 削除/引用 No.11367-17 - 2023/04/19 (水) 12:46:43 - G25 ちょっと話が後戻りしてしまいますが、 顕微鏡で見て核が特に破損している兆候はないとのことでした。 他に核を回収したときにゲノムDNAが溶出してネバネバするなど、核の破綻を示す兆候がなければ、核の回収自体はうまく行っているということでしょう。 ゲノムDNAの断片化はその後の過程に原因があるかもね（機械的せん断、化学的攻撃、ヌクレアーゼなど）。それに関しては、繰り返しになるけどEDTAとかspermidine/spermineは効果が期待できます。

(無題) 削除/引用 No.11367-16 - 2023/04/19 (水) 07:10:49 - リード おおさん、G25さん 追加のアドバイスありがとうございます。 デタージェントについてはtriton x100を使っています。 最初の検討では1%つかい、断線化は軽減されましたが核の抽出量は減少していたように思えます。 （沈殿を目視レベルで顕鏡まではしていません。当初は核以外の細胞小器官の沈殿が避けられたと思っていました） G25さんのご指摘もあり、0.5%まで下げて使用したところ、沈殿の量も回復しています。 追加についてはサンプル待ちの状態でそろそろ検討できるかと思います。 IGEPAL CA-630こちら存じ上げませんでした。 ありがとうございます。購入検討したいです。

(無題) 削除/引用 No.11367-15 - 2023/04/19 (水) 00:25:27 - おお 因みにミトコンドリアを除く事が必要と考えるなら、いくらかのデタージェントを加えたほうがいいと思います。核膜を壊さないといわれているNonidet P-40（NP-40と短縮されるが、現在で回っているNP-40と別物、生産中止されている）が第一選択しかと思います。現在はIGEPAL CA-630が代替品として売られています。ケミカルな構造に関して確認していませんがNonidet P-40 Substituteという商品名で売られているものもあります。 核膜を壊さないと申し上げましたが、やはりそれは濃度依存ではないかと思っています。たとえば培養細胞では0.1% くらいの濃度が使われます。 TRITON X-100やNP-40も非常に似ているので、できなくはないですが、核膜に対する影響は濃度によっては厳しいかもしれません。まあいずれの界面活性剤も核マトリクスは壊さないといわれているのでMgイオンさえあればそんなにダメージはないと思います。

(無題) 削除/引用 No.11367-14 - 2023/04/18 (火) 17:44:36 - G25 「ちゃんとした核」というのはそういう意味でしたか

(無題) 削除/引用 No.11367-13 - 2023/04/18 (火) 16:20:57 - おお >[Re:12] G25さんは書きました : > >また今回はゲノムをとるのが目的でしょうからちゃんとした核をとるというより、核をエンリッチさせればいいので、核をとる従来の方法に忠実になる必要もないかと思います。 > > しかし、ホモジナイズの途中なんかで核が壊れるとゲノムDNAはたちまちせん断されてしまいますから、なるべく断片化が少なくて高分子量のゲノムDNAを取りたいというときは核の保護を考えなければなりますまい。 えっと核を壊してもいいというより、核を調製して実験に使うほど完全な精製度は必要なく、核以外の共雑物が混じっていてもゲノムを調製するには十分でしょうと言いたかったのです。

(無題) 削除/引用 No.11367-12 - 2023/04/18 (火) 14:54:44 - G25 >また今回はゲノムをとるのが目的でしょうからちゃんとした核をとるというより、核をエンリッチさせればいいので、核をとる従来の方法に忠実になる必要もないかと思います。 しかし、ホモジナイズの途中なんかで核が壊れるとゲノムDNAはたちまちせん断されてしまいますから、なるべく断片化が少なくて高分子量のゲノムDNAを取りたいというときは核の保護を考えなければなりますまい。

(無題) 削除/引用 No.11367-10 - 2023/04/18 (火) 02:38:38 - おお >[Re:9] リードさんは書きました : > おおさん > > 不勉強で申し訳ないのですが、sucroseを入れているのは、核を保護する目的と思っていました。違うのでしょうか...？ その点はよくわかりません（オリジナルをさぐっていけばわかる可能性はあります）。細胞の分画で例えば核だけをとるのではなく、ミトコンドリアやその他のフラクションをとることもあるだろうし、そういう意味では浸透圧を生理的に近い状態にしたほうがいいということはあると思います。塩濃度が抑えられるので、各細胞小器官についているものが遊離する可能性も抑えられます。 たとえば培養細胞からミトコンドリアをとるとき、同程度のsucroseを入れますが（マグネシウムは入れてません）、細胞を破砕して核が来るフラクションをとると、場合によって一部ゲル状になっていることがあります。核を保護する効果はあるかもしれませんが（特に組織など）そんなに効果的なものでもなさそうです。マグネシウムの効果のほうが高いような気がします。 また今回はゲノムをとるのが目的でしょうからちゃんとした核をとるというより、核をエンリッチさせればいいので、核をとる従来の方法に忠実になる必要もないかと思います。 組織ということで培養細胞より細胞内のものをとるとき効率が良くない点を考慮に入れると、デタージェントはちょっと入っていたほうがいいのかなと思いますが、今までのデーターで収量はデタージェントあり、なしで比較できますでしょうか。

(無題) 削除/引用 No.11367-9 - 2023/04/15 (土) 14:44:55 - リード おおさん キットでは推奨されているのはサンプル抽出の時に、除たんぱくのバッファーを加えて遠心分離でトロ除くものでした。酢酸臭がしたので、おそらく7.5M 酢酸アンモニウムがベースになっているものと思います。 除たんぱくのバッファーを使うとダウンサイズしやすい...とどこかで見た記憶があってフェノクロ、エタ沈にしています。 フェノールが親和性があるのは初耳でした。クロロホルムだけも試してみようと思います。 絡んだゲノムを取るのは、エタノール添加で糸状のペレットが見えた場合はやっております。 滅菌済みの爪楊枝に絡めて、70%エタノールでwash、TE入りのチューブに指しておいて溶解させています。ご指摘の通り遠心分離での切断を避けたい狙いがあります。 ただ、キットの試薬を使った場合、遠心分離のエタ沈でとって問題はありませんでした。 DNaseに関する文献ありがとうございます。早速読んでみたいと思います。 また、pHでDNaseの活性を下げるのは試してみようと思います。 KClも検討してみようと思います。 手に入りやすい試薬が多くて助かります。 不勉強で申し訳ないのですが、sucroseを入れているのは、核を保護する目的と思っていました。違うのでしょうか...？

(無題) 削除/引用 No.11367-8 - 2023/04/15 (土) 14:33:37 - リード 本当にいろいろとコメントいただきありがとうございます。 早速いろいろ検討したいと思います。 G25さん 確かにEDTAのキレートでMg2+が無効化すると思います。 EGTAは今無いので、EDTAとMgCl2のどちらかのバッファーにしてみようと思います。 TritonX100については細胞小器官が核と一緒に落ちてくるのを防ぐ効果があると聞き、市販のメーカーのバッファーでは泡立ちが確認できたため、TritonX-100を疑いました。 濃度を0.5%に下げてトライしたのですが、回収率は上がりました。 ありがとうございます。 ダウンサーの条件についてもありがとうございます。サンプルが確保でき次第、こちらも試してみようと思います。 因みに顕微鏡で核の具合は市販品と自作バッファーで違いが無いところは確認しています。 そう考えると核の抽出より抽出時のヌクレアーゼの心配をした方が良いかもしれないと思いました。EDTAの濃度はもっと高めてみようと思います。 ２−MEさん ワイドボアは使っていませんが、先落としのチップを使っています。市販品でも同様のものを使ってきれいに抽出できていました。

(無題) 削除/引用 No.11367-7 - 2023/04/15 (土) 03:13:17 - おお フェノールや、エタチンの遠心などの処理ではゲノムが切れてしまう事があるのでが、キットの場合もフェノクロ、エタチンなのですか？ っていうか一緒って書いてますね、、、 フェノクロに関しては高分子ゲノムをとるためのプロトコールとしては大昔は透析をして夾雑物を除くようにするというのがありました、ゲノムからライブラリーを作ったるするプロトコールによく見られます。確かコロジオンバッグにいれて周りを陰圧にすることにより積極的に夾雑物を除いて、さらにバッファー置換もバックでそのままやってという手順だったと思います。フェノールをやめてクロロフォルムだけで処理していくとましになるだろうか、というのもフェノールのほうがDNAに親和性がありそうだから。 エタチンに関しては遠心せずにアルコールを入れて糸状で絡んだゲノムが析出してきたところガラスのパスツールで巻き取り７０％アルコールにじょぼっとつけて洗い、TEなどに移すといった方法もあったようです。 今回はそこはあまり問題がなさそうに見えますが、まあなるべく切断される要因を減らすには寄与するかもしれません。 でやっぱりホモジェナイズ用のバッファーが問題なんでしょうかね。 組織、特に肝臓とかだとｐHが気になりますね。なるべく酸性になるのは避けたい。ちなみに細胞からインタクトな核をとるのに使うのにはｐH8ぐらいのHepesを使ったりします。組織からだともう少し高くてもいいかもと感覚的に思ったりもします。DNaseの活性を抑えるのにも生理的なｐHよりちょっと高いほうがベターかなとおもえますし。DNaseIは弱酸性からｐH８あたりで活性があるようです。ということは８よりも高いほうがいい？DNaseII活性は酸性がわで活性があるようです。 あと、sucroseいるかなぁとも思います。低浸透圧で細胞破裂させたほうが夾雑物も減りますから。 マグネシウムに関しては切れている原因がDNaseによるものなのか、核がルーズになって物理的にやられているのかどちらかで判断が変わってきそうな気がしますね。悩ましいところですが、、、 入れるとしてほかにDNase阻害するものを入れるかなとおもえば、以下の文献でクエン酸、ホウ酸など阻害活性があるようなので応用可能なのかもしれません。 https://reader.elsevier.com/reader/sd/pii/S0223523414006473?token=60A7C0CEF59046BB73986DE666E866CD2B994C88EB2756F72E89972D52414F13FDD5F98A3E97DFF8F4222D9E4E08A605&originRegion=us-east-1&originCreation=20230414175158 あといんたくの核をとるときに１０から２０ｍMのKCLを入れていることも多いですね。 とりとめのない話になってしまいました、、、

(無題) 削除/引用 No.11367-6 - 2023/04/14 (金) 12:18:36 - G25 TNESなるものの組成がわかりませんが、結構、高濃度のEDTA (100 mMとか）があったほうがいいと思います。特にMg++が添加されているなら。 ネットでTNESを検索したら1 mM EDTAなんて組成もあって、それじゃ薄すぎだろって思います。

(無題) 削除/引用 No.11367-5 - 2023/04/14 (金) 12:12:15 - G25 Mg++を添加しないプロトコールもあると思います。 核の保護よりnuclaseの不活性化を優先して、あえてMg++を抜いてEGTA/EDTAを入れるというのはどうか。伝家の古いプロトコールをみたらそういう組成でした。それに加えてspermine/spermidineやPMSF（プロテアーゼ阻害剤）も入っていた。効果の程はわからないけど。

(無題) 削除/引用 No.11367-4 - 2023/04/14 (金) 06:52:38 - 2ME ワイドボア wide bore のピペットチップ（P1000、P200）の使用。

(無題) 削除/引用 No.11367-3 - 2023/04/13 (木) 23:56:57 - G25 核を粗精製した後、検鏡して核の保全具合いをチェックした見るといいかもしれませんね。 > ダウンサーの条件は全く一緒で異なるのは、バッファーの組成だけなので、このバッファーの改良が必要と考えています バッファが違えば最適なホモジナイズの条件が違うということも考えられるから、自作バッファで改めてホモジナイズ条件を最適化してみるという攻め方も排除しないほうが良いように思う。

(無題) 削除/引用 No.11367-2 - 2023/04/13 (木) 23:36:35 - G25 MgCl2(核膜を硬くして核を保護する)を加えておきながらEDTAを添加するのは支離滅裂のような、、、 EGTA? 核を粗製性するまでは膜を壊す界面活性剤(Triton X-100)も(少なくともそんな高濃度では)入れない方がいいのでは？

マウス組織からの高分子DNAの抽出 削除/引用 No.11367-1 - 2023/04/13 (木) 23:03:59 - リード ゲノムDNAの抽出に詳しい方に質問させてください！ （博士課程1年です） マウスの脳、肝臓、筋肉出来れば他の組織からも高分子のゲノムDNA（50kb以上）を抽出したいと考えています 現在、何社かの高分子ゲノムDNAの抽出キットを試しました ＜方法＞ １　組織をホモジェナイズ用のバッファーに加えてダウンサーで処理 ２　2000g5分で遠心分離 ３　ホモジェナイズ用のバッファーを使って再懸濁（wash） ４　2000g5分で遠心分離 ※核画分（粗核画分） ５　核画分にTNESとProK、RNaseAを加えて55度でインキュベート ６　フェノクロ→イソプロ沈 　2社の高分子ゲノム抽出キットに添付されているホモジェナイズバッファーを使うと想定していた通りの高分子のゲノムDNAが回収できました しかし、2社ともに試供品を提供してもらっていただけでして、何とか自作のバッファーで対応できないか検討しています また、上の方法の他に、組織をホモジェナイズしてTNESとProK処理も試しましたが、10kb以下の小さいゲノムDNAが多く含まれていました ホモジェナイズした後に核分画するところが高分子のゲノムDNAを取得するためのポイントと考えて ・1980年代の細胞分画の文献より 〇7.5% スクロース + 10ｍM MgCl2 　＋100mM Trisを加えたバッファー 　＋100mM Trisと10mM EDTAを加えたバッファー 　＋100mM Trisと10mM EDTA、1%TritonX100を加えたバッファー このあたりを試しました しかし、これらのバッファーで抽出するとゲノムDNAの平均長が10-20kbに下がります 抽出操作（方法の５，６）とダウンサーの条件は全く一緒で異なるのは、バッファーの組成だけなので、このバッファーの改良が必要と考えています どなたかアドバイスまたは文献を教えていただけませんでしょうか？

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