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(無題) 削除/引用 No.11365-11 - 2023/04/16 (日) 22:22:08 - Skeptics 皆さんがああでもないこうでもないと書き込んでいるのにトピ主さんからのフィードバックがないものだから、もし仮に××だとしたら○○だけど…という回答が続くいつものパターン。 質問をしている方は切実にその答えを知りたいわけじゃないんですかね？

partial-fill-in 削除/引用 No.11365-10 - 2023/04/15 (土) 15:49:48 - oyaji klenow使ってpartial-fill-inという戦法。BamHI　（BglII)、、、-XhoI(SalI) XhoIの完全切断はなかなか行かない。（切れ残りありと、思った方が健康的思考かと、、、） ・・・「秘伝だよ」

(無題) 削除/引用 No.11365-9 - 2023/04/14 (金) 06:10:51 - おお BamH1とXho1で切った末端を持つインサートを入れるのでしょうか？ それならちょっとやってみたいなと思うことは、プラスミドを例えばBamH1できって、この状態でインサートをLigationする。そうするとXhoIがわのBamH1切断箇所とその反対側両方にインサートのBamH1切断箇所がLigationされます。そのあとXhoIで切断してからセルフLigationさせる。 XhoIがわがべつにXhoIを保存しないでいいなら上記のようにプラスミド切断、BamH1断片箇所をLigationし、その後ブランティング処理してセルフライゲーション。 脱リン化によりセルフを防ぐのは常套手段で私もよくやってましたがワークしてました。もしバックグランドが気になるなら、ベクターだけでLigationをやっておいて形質転換してバックグランドを見積もってから、ベクターの量をバックグランドが１０前後になるくらいに調製してLigationするとバックグランドが多くてあたりを引くのが大変ということは避けられます。わたしはこれでインサートが入ったクローンが拾ったクローンの５０％から９０％になってましたので４つクローン拾えばいいかみたいな時もありました。

(無題) 削除/引用 No.11365-8 - 2023/04/13 (木) 19:23:41 - G25 それと、single digestでクローニングした場合、directional cloningではなくinsertの方向性がコントロールできなくなりますね。 正逆ランダムで確率1/2ならいいですけど、往々にして逆向きばっかり取れて、ほしい正方向のがなかなか取れないということがあります（逆方向のクローンが高いバックグラウンドになる）。 正方向だとコードされているタンパク質が漏れ発現して、宿主に毒性や負荷をあたえることがるためです。

(無題) 削除/引用 No.11365-7 - 2023/04/13 (木) 18:59:09 - momo Amp耐性遺伝子の中にuniqueなPstIサイトがあるようですので、XhoI-PstI断片とPstI-BamHI断片を別々に切り出して、インサートと合わせてthree piece ligationしてはどうですか？

(無題) 削除/引用 No.11365-6 - 2023/04/13 (木) 18:55:41 - G25 ちゃんと完全消化されているならば脱リン酸化したらself-ligationなんでほとんど起こらないです。alkaline phosphatase (AP)はかなり強力な酵素です。 多くの人がセルフライゲーションだとか再環状化だとかと言っているバックグラウウンドコロニーは、APの効きが悪いからじゃなくて、切れ残りのプラスミドが混じっているからです。アルカリ法で精製したプラスミドは多かれ少なかれ部分変性して制限酵素が効かなくなった分子が生じます。少量とって電気泳動して消化をチェックしても見えないくらい微量でも、形質転換すれば多くの非組換え体コロニーを生じえます。 切れ残りのプラスミドを排除するために、アガロースゲル抽出で消化されたDNAバンドを切り出せば、バックグラウンドは大幅に軽減されます。

(無題) 削除/引用 No.11365-5 - 2023/04/13 (木) 17:53:01 - pET G25さん、丁寧なご回答ありがとうございます。 例えば、経験上、Xho1あるいはBamH1のどちらかのみを使って、クローニングした場合、脱リン酸化処理を行ったとしても、セルフライゲーションによるバックはかなり高くなりますか。

(無題) 削除/引用 No.11365-4 - 2023/04/13 (木) 17:23:25 - G25 あと、二重消化が不完全でself-ligationのバックグラウンドがひどくなりそうだとしたら、こういう手段も考えられます。 インサートの末端の制限酵素サイトをPCRプライマーに組み込んで作る場合、 BamH1の代わりにBgl2サイトに、またはXho1の代わりにSal1にします。 Bgl2末端はBamH1末端に、Sal1末端はXho1末端にライゲーションされます。 これらの組み合わせで連結されると、前者はBamH1で、後者はXho1で再切断できなくなります。 ligation反応のあとで、BamH1またはXho1で処理すればself-ligationしたベクターのみが消化されてバックグラウンドを下げることができるでしょう。

(無題) 削除/引用 No.11365-3 - 2023/04/13 (木) 17:14:24 - G25 pUCのBamH1-Xba1はオーバラップなしに隣り合っているので、 一塩基オーバーラップのあるBamH1-Eco88I/Cfr9Iの組み合わせのほうが近いですね。Fermentasにのみ資料があります。 Cfr9IはBamH1の前でも後でも同程度、Eco88IはBamIの前のほうが高効率です。 私はXho1をBamH1の前にしたほうが良さそうな気がしています。

(無題) 削除/引用 No.11365-2 - 2023/04/13 (木) 17:05:31 - G25 TakaraとFermentasがクローニングサイトで近接した二箇所を切る時の切断効率の資料をだしています。 TAKARAのは、 https://catalog.takara-bio.co.jp/product/basic_info.php?unitid=U100006081 FermentasはThermoに吸収されてしまってWeb上の資料は見つけられませんでした（古い印刷版のカタログを見ています）。 ただし、古典的なpUC系のクローニングサイトで調べた古い資料なのでXhoIの情報はありません。参考になるのはBamH1とhead-tailで並んだXba1との組み合わせでしょう。 TAKARAの資料のイントロに書いてあるとおり隣り合っているサイトの同時消化は困難な場合が多く、サイトが末端ギリになっても切れやすい酵素が後になるように順次消化することを考えます。 TAKARAの資料ではXba1->BamH1はOKで、BamH1->Xba1はNGとなっています。 BamH1を後にしたほうが良さそうです。 しかし、Fermentasの資料ではBamH1->Xba1のほうが効率がいいことになっているので、どっちを取るかはあなた次第。 また、末端付近にあっても切れやすい方をあとにしたほうが良さそうですが、 末端付近の制限酵素サイトに足場となる余剰のヌクレオチド対がナンボ必要かという資料を見ると、 FermentasではXba1やXho1よりBamH1のほうが切れやすそうですが、 NEBの資料では逆のように見えます。 どうも資料からは首尾一貫した見解は得られないようです。 確かなのは、同時消化はダメで順次消化をすべきということだけ。 順序は、両方とも同時にやってみて成績の良いほうを取ればいいのではないでしょうか（やろうと思えばself-ligationの起こりにくさを比較して二重消化の効率をはかる事もできましょう）。どっちにしても、完全消化は困難かもしれません。

pETプラスミドの制限酵素による切断 削除/引用 No.11365-1 - 2023/04/13 (木) 15:02:11 - pET pET16bプラスミドのBamH1,Xho1サイトは1塩基重複がありますが、この2酵素で切断することはできますか。 よろしくお願いします。

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