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半定量PCRでの最適な増幅産物長 トピック削除
No.11356-TOPIC - 2023/04/10 (月) 19:10:45 - 増えず
ネットでリアルタイムPCRのプロトコルを検索するとよく「PCR産物は150bp以下に設計した方が良い」と出てくるのですが、これはPCR産物をゲルで電気泳動してバンドの輝度を測る半定量PCRにも当てはまるのでしょうか。

私は細胞を使って複数の遺伝子の発現変動を上述した半定量PCR法で見ているのですが、同じサンプルでもPCRをかける度にバンドが見えたり見えなかったりして結果の再現性が低く困っています。

そこで安定した半定量PCRの結果を出している別の人に聞いてみると、私はPCR産物が150bp程度になるようにプライマーを設計していたのに対して、その人は300bp程度になるよう設計しているとのことでした。

てっきり半定量PCRの場合もPCR産物が短い方が良いのかと思い150bpのものを設計していたのですが、半定量PCRはqPCRと違う最適な産物の長さがあるのでしょうか。
　
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(無題) 削除/引用
No.11356-6 - 2023/04/11 (火) 04:31:00 - あの
既に指摘がある点以外では、もしエチブロを使っているなら、
もっと高感度の染色液に替えることも必要だと思います。

(無題) 削除/引用
No.11356-5 - 2023/04/11 (火) 04:04:00 - おお
指摘があるように長すぎるとPCRの効率も減ってきます。同じ配列を比べるのだからそれでもいいと理屈では言えるのですが、なるべくなら理想的に近いほうが環境による違いのブレも最小限に抑えることができそうなので、まあ３００ぐらい長くても５００ぐらいまでで長さはプライマーの設計の都合で決めればいいと思います。１５０でもいいとは思いますが、短いとMoleあたりの蛍光強度が減りますので検出できる時には結構増幅されてしまっている可能性もあるのかもしれません。

かかりにくいと思えるなら、プライマーを変えるか、条件を変えるかでよりよい条件を探してください。体Tm値が60℃ぐらいなら６０度強のアニーリング温度でもPCRは可能かと思います。

(無題) 削除/引用
No.11356-4 - 2023/04/11 (火) 02:31:50 - length
仰る通りで、基本的にはPCR産物の長さが短い方が増幅しやすいです。

（教科書的にもそうだし、自分の経験的にもそうです。複数組のプライマーでのPCRでのことなのでちょっと違う話かもしれませんが、発現の多いhouse keeping geneを600bp、発現の少ない目的遺伝子を200bpとして一度にPCRをかけると、ゲルでの見かけ上の発現量は目的遺伝子の方が多くなったりすることがある位です。これを考慮にいれると、multiplex PCRって信用できるか？というのが私の中にあるのですが、実際にやっておられる方はどう思ってるかコメント頂けたら嬉しい）。

もっとも、短か過ぎるとゲル上での分離が面倒（濃い目のゲルを作る必要があったり）になったりします。その上で、150bpは問題の無いサイズと思います。

問題は
>同じサンプルでもPCRをかける度にバンドが見えたり見えなかったり
のところでしょう。
長さと関係なしに、単純にプライマーが良くない（増幅効率が悪い）のでは？自分だったら別の領域にもう2−3組プライマーをデザインして、全プライマーを一度に試してみます。

最近のPCR酵素は安いものでも特に問題無く、しかもたかだか150bpの増幅であれば、サーマルサイクラーの条件が多少違っても特に変わりなく増幅すると思います。念のために一度アニーリング温度を低めにして回しても良いとは思いますが、自分だったらあまりその辺は気にしないです。経験的には、プライマーを変えるのが一番手っ取り早いです。

(無題) 削除/引用
No.11356-3 - 2023/04/10 (月) 22:24:52 - 7700
長さとか関係ないだろ。何を気にしてんだ？

(無題) 削除/引用
No.11356-2 - 2023/04/10 (月) 19:14:37 - 増えず
補足として、プライマーはどれも大体Tm値が60℃ぐらいになるよう設計しており、サーマルサイクラーの条件は
denature：94℃/30s → annealing：58℃/30s → extension：72℃/30s
を30〜35サイクルでPCRを大体かけています。

半定量PCRでの最適な増幅産物長 削除/引用
No.11356-1 - 2023/04/10 (月) 19:10:45 - 増えず
ネットでリアルタイムPCRのプロトコルを検索するとよく「PCR産物は150bp以下に設計した方が良い」と出てくるのですが、これはPCR産物をゲルで電気泳動してバンドの輝度を測る半定量PCRにも当てはまるのでしょうか。

私は細胞を使って複数の遺伝子の発現変動を上述した半定量PCR法で見ているのですが、同じサンプルでもPCRをかける度にバンドが見えたり見えなかったりして結果の再現性が低く困っています。

そこで安定した半定量PCRの結果を出している別の人に聞いてみると、私はPCR産物が150bp程度になるようにプライマーを設計していたのに対して、その人は300bp程度になるよう設計しているとのことでした。

てっきり半定量PCRの場合もPCR産物が短い方が良いのかと思い150bpのものを設計していたのですが、半定量PCRはqPCRと違う最適な産物の長さがあるのでしょうか。
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