先生方
いつもお世話になっております。
THP-1細胞 (floating cell)へのプラスミド導入のための系がうまくいかず、良き方法をご存知でないかご相談させてください。
これまでのpaperからelectropolationの系が多かったので、まずElepoを試しました。
結局どのpaperでもお前のところで条件検討しないとあかんぞ、みたいに書いていて、再現性が取りづらいことは覚悟していました。そこで、まず導入プラスミドがない条件で調べましたが、この操作だけでも増えてこないという状況です。
ElectroporationはBioRad Gene pulser X cellで、4 mm キュベット、OPTIMEM で 2.5*10^6/250 µl、150V or 200 V or 250 Vで950 µF, ∞Ωで行いました。条件は950 µFはどのpaperもそうで、Vは250前後くらいでしたのでそれを参考に行いました。が、死んだもんですから200, 150と下げたが、これらの条件でも死んだことが見られたところで、これ以上Vを下げるとプラスミド入らんだろうというところで、この条件は中断しています。細胞は活きのいいものを使っています。増やしすぎや起こしたてなどは使用しておりません。 elepoのあとは速やかに10% FCS-RPMI培地(6 well plate)で incubationかけます。次の日には藻屑になっていて、ちょろちょろ生細胞もいる'風'ですが、1週間ほど放っていても全くダメです。
elepoはあまりやらないため、どこの条件をいじったものかと困っています。周りも細菌にelepoする方ばかり(私もそうですが)で、mammal細胞を扱っておらず相談できるかたが近場にいないというところです。
LipofectionもThermoのlipofectamine 3000で、一般的なprotocol通りに行ってみました。LipofectionはFloating cellで効率よくできるイメージはなかったですが、やはりそうで、こちらは操作の後には細胞は生きましたが、プラスミドに入っている耐性遺伝子で選択するために、puromycinでselectionしたら死にました。もちろんpuromycinの適正濃度はcheckしております。(0.5 µg/ml)
THP-1自体、ぱらぱらしすぎていると(少ないと)増えづらい印象は確かにあったので、wellを小さくして密度を高めてみてもdebrisが多いからかやはり増えず、困っています。
皆様からsuggestionいただけますと幸いです。
足りない情報もできる限り開示いたしますので、お声掛けください。
よろしくお願い申し上げます。
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