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(無題) 削除/引用 No.11353-6 - 2023/04/11 (火) 08:55:16 - あああ おお様 ありがとうございます。自作ですね。たしかに組成はいろいろな論文で紹介されているので、ATP、MgCl2、DTT、Coenzyme A を購入して、Tris-HClに溶かせばいいですね。 G25様 ありがとうございます。CoAはなくても何とかなるが、入っていた方が、良いのですね。

(無題) 削除/引用 No.11353-5 - 2023/04/10 (月) 16:40:08 - G25 なんでCoAが入ってるんだろうと思ったら、 luciferaseがproduct inhibitionを受けるのをCoAが防止するので発光寿命が長く安定化するんですって。どうやら、luciferaseの祖先がFatty acid shythaseであることと関係があるようです。知らなんだ。皆さん、知ってました？ https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/16218952/ だから市販品にしても自作にしても最近はCoAが加えられるのがスタンダードになっているらしい。

(無題) 削除/引用 No.11353-4 - 2023/04/10 (月) 14:29:57 - おお >[Re:3] あああさんは書きました : > G25様 > > ありがとうございます。バッファ組成やプロトコルについて詳細にご提示いただき、大変参考になります。 > MgClやATPの濃度はbio protocolとJournal of Biomolecular Screeningのものはかなり差が大きいですね。 > > NEBで売っているT4 DNA Ligase Reaction Bufferで代用できそうな気がしますがいがかでしょう？ > いや、そんな大したものは入ってないんだから作ればいいと思うけど。確かDTTが大抵入っていて、まあまあ高い濃度だったとおもう。

(無題) 削除/引用 No.11353-3 - 2023/04/10 (月) 12:27:07 - あああ G25様 ありがとうございます。バッファ組成やプロトコルについて詳細にご提示いただき、大変参考になります。 MgClやATPの濃度はbio protocolとJournal of Biomolecular Screeningのものはかなり差が大きいですね。 NEBで売っているT4 DNA Ligase Reaction Bufferで代用できそうな気がしますがいがかでしょう？ ttps://international.neb.com/products/b0202-t4-dna-ligase-reaction-buffer#Product%20Information ttps://international.neb.com/faqs/0001/01/01/what-is-the-composition-of-the-t4-dna-ligase-reaction-buffer

(無題) 削除/引用 No.11353-2 - 2023/04/10 (月) 10:13:44 - G25 要はホタルルシフェラーゼですから、それに適用できる反応バッファーは文献にいくらでもあるはずですね（CoAが入るレシピは見たことないので、必須ではないと思う）。自作したらいいんじゃないでしょうか。 培養細胞のLucアッセイの場合、市販品の場合はlysisとLuc反応が両立できるバッファになっているのが多いようですが、そういうのも自作できると思います。 luciferase reaction buffer homemadeで検索したらさっそくこんなのありましたけど、 ttps://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC4186351/ ttps://bio-protocol.org/exchange/preprintdetail?id=726&type=2 ttps://www.slas-discovery.org/article/S2472-5552(22)07490-1/pdf

ルシフェラーゼアッセイ用のバッファの入手方法 削除/引用 No.11353-1 - 2023/04/10 (月) 09:44:09 - あああ いつも勉強させてもらっています。 in vitroでルシフェラーゼアッセイを予定しています。 プロメガのLuc2遺伝子を搭載したプラスミドのトランスフェクション効率を調べます。 これまで動物を使った実験ではトランスフェクション後にD-ルシフェリン基質を単純に腹腔内投与するだけで発光していました。 この度in vitroで同じLuc2を使ったトランスフェクション効率を使ったアッセイを予定しているのですが、Gold Biotechnologyの資料など調べてみるとMgCl2やATPを含んだバッファが必要なようです。 Tris-HCl, Ph 7.8 MgCl2 Coenzyme A (CoA) (hydrate)ATP (disodium salt hydrate) GLSS (GoldBio Luciferin Stock Solution) プロメガの基質+バッファのキットを購入するのが手っ取り早そうなのですが、高価です。 D-ルシフェリン基質自体は持っているので、バッファだけをできるだけ安価に入手したいのですが、どこかで入手できるかご存じないでしょうか 1回のアッセイで4~5mL使うので100mLくらいのスケールで入手できるとありがたいです。

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