全14件 ( 1 〜 14 )　 前 | 次 　1/ 1. /1

(無題) 削除/引用 No.11350-14 - 2023/04/10 (月) 16:17:42 - G25 先程書いたように、ヌクレオチドを取り込み損なうと、それ以上伸長しないようにアセチル化でブロックされるため、真中部分が欠失したオリゴというものは原理的にできないようになっているはずです（実際上、どれほど完璧であるかはわかりませんが）。 >末端が削れたものだけって変じゃないですか？ 取り込みにしくじるとそこで中絶するので、3'末端から途中までの不完全長のプライマーになるわけです。あまりに早期に中絶したオリゴはPCRプライマーとして機能しなくて、あっても産物を生じないだけかもしれない。 まあ、実際そういう問題がおこる可能性があるからこそ、No.11350-11 のリンクにあるような注意書きがあるんじゃないでしょうか。 >実際に脱塩スケールでプライマーの品質が悪かったと言ったことは、皆様の経験上はございますか？ No.11350-9の最後のパラグラフが答えの一例になるでしょうか。 本当に不完全長のオリゴが本当に顕著に混入しているのかはHPLCやTOF-MSがあればかんたんにチェックできるし、ちょっと手間だけどPAGEでも見られます。 かつては合成を外注するとデフォルトのQCでやってくれるのが普通だったけど。最近は合成の精度が高くなったためかやらないのが普通になってるのかな。

(無題) 削除/引用 No.11350-13 - 2023/04/10 (月) 14:23:33 - おお >[Re:12] ERKさんは書きました : > >ま、いずれにしろスキップする場所はランダムとするとおんなじ配列の分子ばかりできる訳ではないしプライマーが原因と言うのはちょと不思議かなと。ただし5‘あたりが非常に合成しにくい配列であれば別ですけど。 > > 真ん中部分が欠けたオリゴよりも5'末端が欠けたオリゴのほうがPCRプライマーとして機能しやすいということはありますよ。 > > 正しい配列のオリゴも混じってますよね。それに、末端の方が欠けるにしても、どっちのプライマーかのバリエーションもあるだろうし。まあいずれにしろランダムに起こるものを使って 末端が削れたものだけって変じゃないですか？

(無題) 削除/引用 No.11350-12 - 2023/04/10 (月) 14:05:14 - ERK >ま、いずれにしろスキップする場所はランダムとするとおんなじ配列の分子ばかりできる訳ではないしプライマーが原因と言うのはちょと不思議かなと。ただし5‘あたりが非常に合成しにくい配列であれば別ですけど。 真ん中部分が欠けたオリゴよりも5'末端が欠けたオリゴのほうがPCRプライマーとして機能しやすいということはありますよ。

(無題) 削除/引用 No.11350-11 - 2023/04/10 (月) 13:28:14 - 2ME プロトコールに書いてあるので、プロトコールを読もう。 https://lifescience.toyobo.co.jp/user_data/pdf/products/manual/SMK-101.pdf 「5’端が欠落している不完全なプライマーが混入している場合には、最終的にセルフライゲーションジャンクションでその塩基が欠失してしまうことになります。従って、プライマーは、HPLC精製グレードのものを使用されることをお奨めします。特にプライマーの5’端近傍に同一塩基の連続がある場合には、HPLC精製グレードのプライマーのご使用を強くお奨めします。また、40merを超えるプライマーの場合は、PAGE精製グレードにされることをお奨めします。」

(無題) 削除/引用 No.11350-10 - 2023/04/10 (月) 12:24:38 - おお >[Re:9] G25さんは書きました : > >３’側に行くにつれて不正確になっていくと思っています（私の感違いだったらご指摘ください） > > 固相合成の場合は3'->5'方向ですね。 あ、そうでしたか。思い出せなかったので勢いで書いてしまいました。確認してから書くべきでした。 ま、いずれにしろスキップする場所はランダムとするとおんなじ配列の分子ばかりできる訳ではないしプライマーが原因と言うのはちょと不思議かなと。ただし5‘あたりが非常に合成しにくい配列であれば別ですけど。

(無題) 削除/引用 No.11350-9 - 2023/04/10 (月) 12:10:03 - G25 >３’側に行くにつれて不正確になっていくと思っています（私の感違いだったらご指摘ください） 固相合成の場合は3'->5'方向ですね。 化学反応は100%というわけにはいかないので、一ヌクレオチド付加するごとに一定の取り込み損ないがあります。ヌクレオチド付加に失敗するとそれ以上伸長しないように5'-OHをアセチル基でブロックするので、途中でヌクレオチドをスキップしたものはできない設計です。それも100%ということは無いでしょうけど。 一段階ごとに一定の頻度で間違ったヌクレオチドを取り込むというのなら伸長が進むほど「不正確になる」ということになるでしょう。しかし、実際には一段階ごとに一定の頻度で脱落するので、長い合成オリゴオリゴDNAほど、5'側が伸長しきらず完全長に達しないフラクションが増えるということが問題なのだと思います。 脱塩精製だと中断したオリゴがすべて混じってくる、 逆相カラムだと、最後に付加したヌクレオチドの保護基が付いたまま（trityl-on)の完全長オリゴが濃縮される、だったかな。 それでも不完全長が混入が問題になる場合にPAGE精製などのオプションがある。 最近じゃ合成の性能があがったからか、脱塩だけでも不完全長の混入はあまりないように見受けられます。昔は脱塩だけのオリゴをプライマーにしてシークエンスなんかはできないくらいだったけど（3'伸長端側の配列は正しいけど、長さがまちまちのプライマーが混在するのでずれた波形が重なってしまう）。

(無題) 削除/引用 No.11350-8 - 2023/04/10 (月) 05:59:16 - おお メーカーによってはMSでサイズを確認したりしてますが、それはそうとほんとに合成、脱塩でそんな削れているのはちょっとへぼいかんじがしますね。。。合成で一番問題になるのは伸長させていくときの効率で３’側に行くにつれて不正確になっていくと思っています（私の感違いだったらご指摘ください）。 そのプライマーのとくに５’あたりGが並んでいるとかありますか？Gが並ぶと合成しにくくなるようでスキップされたものが多い可能性はありますが、、、あるメーカーはGが４つ以上並ぶのは避けてくれと昔言ってました。そういう事情なら精製度を上げるのが解決方法かもしれません。PAGE精製だとサイズによって分画されるので（HPLCもそうだと思うけど）、プライマーの問題であれば回避できると思います。

(無題) 削除/引用 No.11350-7 - 2023/04/10 (月) 00:25:40 - PCR > どれもフレームがずれているとすると、作製しようとしている欠失型のタンパク質が大腸菌にとってtoxicであるという可能性も考えられます。 これが理由の場合、iPCR、セルフライゲーション後に得られる形質転換体が極端に少なくならないでしょうか？具体的な数値は差し控えましが、これまで行なってきた実験と比較して同程度ですが。

(無題) 削除/引用 No.11350-6 - 2023/04/10 (月) 00:17:47 - PCR 末端リン酸化されていないプライマーでPCRをして、Dpn1による鋳型プラスミドの分解をした後に、KinaseとLigaseの同時反応によりセルフライゲーションをしています。東洋紡のKOD -Plus- Mutagenesis Kitです。

(無題) 削除/引用 No.11350-5 - 2023/04/09 (日) 23:17:19 - momo 末端リン酸化されたプライマーでPCRをして、blunt endライゲーションをしているということについては間違いないということですね？ここを確認しないと議論が先に進まないので。 数個チェックしたとありますが、いくつチェックしました？いくつもチェックして、どれもフレームがずれているとすると、作製しようとしている欠失型のタンパク質が大腸菌にとってtoxicであるという可能性も考えられます。

(無題) 削除/引用 No.11350-4 - 2023/04/09 (日) 22:21:48 - PCR 皆様、回答ありがとうございます。 シーケンスしたものがまだ数個なので、もう少し行ってみたいと思います。おそらくですが、リン酸化はしています。酵素が失活している可能性も否定はできませんが...。 シーケンスして、同じ結果になるようでしたら、プライマーの精製グレードを上げてみたいと思います。 どこのものを使用しているが明言することはしませんが、これまで脱塩スケールのプライマーで実験をしてきて、特に問題なかったのですが、実際に脱塩スケールでプライマーの品質が悪かったと言ったことは、皆様の経験上はございますか？ 特定の塩基が連続しているようか特殊なものは、1塩基2塩基抜け落ちているものもありそうですが、本実験で使用しているものは、そのようなものではありません。

(無題) 削除/引用 No.11350-3 - 2023/04/09 (日) 18:37:40 - G25 inverse PCRと言っても少々　バリエーションがありますが、単純に平滑の両末端をライゲーションするだけの方法ですか？ 末端リン酸化はしてるんですよね。ないとは思うけど、リン酸化されていなくて、たまたま末端が削れてリン酸基が露出したものだけが環状化してるとか、、 オーダーしたプライマー配列が正しくても、合成反応は100%の効率ではなく、ヌクレオチドが一 二個足りないような分子は多かれ少なかれ混じってきます。そういうのを厳密に除去するためにPAGE精製をかけることがあります。

(無題) 削除/引用 No.11350-2 - 2023/04/09 (日) 16:24:57 - KN プライマーの品質が低く、5’末端の塩基が抜けているものが多いとか。 10個拾って同じ結果ならプライマーを合成し直します。

Inverse PCR 削除/引用 No.11350-1 - 2023/04/09 (日) 13:10:56 - PCR こんにちは。 Inverse PCRによりプラスミドの遺伝子配列の特定の領域を除去する実験を行っています。数個シーケンスを行ったところ、特定領域に加えて、隣接する塩基配列2残基も余分に除去されているようでした。 考えられる原因と対処法をご教授いただけないでしょうか。ちなみにプライマーの配列は間違えていませんでした。

全14件 ( 1 〜 14 )　 前 | 次 　1/ 1. /1

パスワードを入力してチェックした記事を

チェックした記事を

このトピックにメッセージを投稿する 名前  メール  　アドレス非公開    タイトル  本文       設定  クッキーを保存（次回の入力の手間を省けます） 上に上げない（トピックの一覧で一番上に移動させません） 解決（問題が解決した際にチェックしてください） 暗証  半角英数字8-12文字の暗証番号を入れると、あとで削除、修正ができます。 送信

---

〔使い方〕 「アドレス非公開」をチェックすれば、自分のメールアドレスを公開しないで他の方からメールを受け取れます。 問題が解決した際には、解決ボタンをチェックして解決した旨のコメントをつけてください。これは、初めにトピックを作った人と管理人のみが可能です。 半角カタカナ、機種依存文字(全角ローマ数字、○の中の数字等)は文字化けの原因となりますので使わないでください。

---