マウス脳で蛍光免疫染色を行っているのですが、いくつか問題が発生したので質問を立ててみようと思いました。
@ クライオスタットでの薄切について
マウスの灌流固定をした後、30%SucroseでCryoprotectionした後、ドライアイスパウダーでOCTに入れた脳を包埋しました。その後、クライオスタットで薄切作業に入ったのですが庫内温度-20度で上手く薄切できる時もあればグジャグジャになってしまう時もあり安定しません。庫内温度については何回か質問させていただいて、そのときの状態を都度確認しながら調節すべきとの回答をいただきましたが、皆さんは何度くらいで薄切しているのでしょうか。ちなみに免疫染色時のバックを考えて15μmで切っています。
A 薄切時について
薄切している時に、よくコンパウンドと脳が分かれて剥がれてしまいます。包埋するときに水分はよくきってから包埋しているのですが何かアドバイス頂けないでしょうか。
また、先の細いブラシでハンドルを回しながら薄切したものを回収しているのですが、脳が柔らかいのか脳だけグジャグジャになってしまいます。さまざまな原因を考えましたが今のところ灌流固定がしっかりできていないのかなと考えております。灌流固定がしっかりできていないと脳が柔らかくなり綺麗に薄切できないということはあるのでしょうか。
稚拙な文かもしれませんがお手柔らかにお願いいたします。。。 |
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