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(無題) 削除/引用 No.11338-10 - 2023/04/12 (水) 06:46:42 - あの 在米でしたか。 当方が書いたニ項目は、当方で実施しているl初代培養系では、大きな違いをもたらします。 日本でも、一時、ローバインディングが入手難でしたが、今はメーカーにこだわらなければ、比較的に容易です。 御成功を祈ります。

(無題) 削除/引用 No.11338-9 - 2023/04/12 (水) 02:31:41 - おお フィードバックありがとうございました。よかったです。

(無題) 削除/引用 No.11338-8 - 2023/04/12 (水) 02:22:50 - RNA 皆様、引き続きありがとうございます。 >おおさん アドバイスに従って、1)遠心は室温で行い、2) Elution Bufferは予め50-55Cまで温めておき、3) Elutionは二回に分けてそれぞれ30ulで行う、という方法を試してみたところ、良好な結果が得られました。単純に収量が平均で（悪かった時に比べて）5から8倍以上になりました。260/280の比も問題無しです（ゲル電気泳動までは行っていません）。大幅な改善が見られました。ありがとうございました。 >あのさん 当方在米なのですが、コロナの影響で、チップやチューブに関しては未だに欲しいメーカーの物がきちんと手に入らない状態です。バリアチップすら数が揃わず、RNA実験でも普通のチップを使ってる状態です。まあ、20年以上前は皆それでもきちんとRNAでの実験が出来ていたのだから、と言えばそれまでなのですが。日本ではどうでしょうか？ 共沈剤は効果有りますか？昔グリコーゲンを試した時は収量に関しては改善が見られなかった（沈殿が見やすくはなった）覚えがありますが、今後更に小さいdishでの実験を行う場合などには考慮したいと思います。ありがとうございました。 >のなめさん 実は、安いからと言ってキットを変えるのはあまり好きではなく（今のボスがお金を取ってくるのが上手いから言える贅沢ではありますが）、上手くいってる時はキットを変えないで欲しいなあ、というのが本音です。でも情報は有り難いです。お金が厳しくなってきたらそちらの製品についても考慮したいと思います。ありがとうございました。

(無題) 削除/引用 No.11338-7 - 2023/04/11 (火) 09:11:29 - のなめ トピックの趣旨から離れますが、安さで言うならニッポンジーンのキットのほうがだいぶ安そうですよ。

(無題) 削除/引用 No.11338-6 - 2023/04/11 (火) 04:36:34 - あの 念のためですが、次の２点も、未使用なら導入を検討してください。 　　ローバインディングのチップやマイクロチューブの使用 　　エタ沈メイトのような共沈剤の使用 組織からの抽出では、これらは無視できますが、細胞からだと 収量に大きく影響します。

(無題) 削除/引用 No.11338-5 - 2023/04/11 (火) 04:04:57 - おお >[Re:4] 7700さんは書きました : > >[Re:1] RNAさんは書きました : > > そんなに質の悪いキットを名の通った企業が今時販売するか？とも思っていて、 > > キットの性能なんてメーカー毎にピンキリでしょ。 > キリであっても、自分の用途には間に合ってるからヨシ、って割り切って使ってるんだよ。 具体的にお願いできますか？

(無題) 削除/引用 No.11338-4 - 2023/04/10 (月) 22:31:36 - 7700 >[Re:1] RNAさんは書きました : > そんなに質の悪いキットを名の通った企業が今時販売するか？とも思っていて、 キットの性能なんてメーカー毎にピンキリでしょ。 キリであっても、自分の用途には間に合ってるからヨシ、って割り切って使ってるんだよ。

(無題) 削除/引用 No.11338-3 - 2023/04/08 (土) 12:16:27 - RNA おおさん、ありがとうございました。大変参考になりました。それと、実は以前は室温の遠心機を使っていたのですが、壊れてしまった為に最近は4度の遠心機を使っていることに気付きました。これも良くなかった可能性があるんですね。 おおさんのアドバイスを参考にプロトールに修正を加えたものを書いて、一度その方法でやってもらおうと思います。

(無題) 削除/引用 No.11338-2 - 2023/04/06 (木) 07:15:10 - おお 質を評価する材料はありませんけど、BioRadのほうは８０uｌで溶出するのを標準プロトコールにしていて、量が少ないときは４０でいいという書き方をしていますね。一方Qiagenのほうは、若干少ないようです。また、BioradのほうのTrouble shootingには Inefficient elution： Preheat the elution　solution to 70°C in　water bath prior to　the elution step https://www.bio-rad.com/sites/default/files/webroot/web/pdf/lsr/literature/4110133.pdf まあ少しRNAの結合が強いんじゃないかとおもわれます。こういうカラムに言えることは、溶出を２回に分けたほうが収量が上がることがおおいです。３０uｌで溶出してさらにもう一回３０uｌで溶出するとか。あと温度が高いほうがいいようなので冷却された遠心機は使わないほうがいいのかもしれません。このてのカラムで（たしかDNAのほうだったと思うのだけど）温度は気を付けたほうがいいという人がいたのを思い出しました。 あと収量でネックになるのは乗せるときにつかないということですが、そのひとつの原因がLysisバッファーが薄まりすぎてしまうということ。若干多めにするといいかもしれません。人によってはFlow throughをもう一度カラムに乗せ取りこぼしを防ぐみたいなやり方をする人がいますがどこまで効果的かはわかりません。

RNAの抽出、キットによって収量が変わる？ 削除/引用 No.11338-1 - 2023/04/06 (木) 03:54:11 - RNA ラボテクにお願いして培養血管内皮細胞からRNAを抽出してもらっています。 以前はQIAGENのRNeasyを使っていて、特に問題無くやっておりました。 最近、別チームのラボメンバーがこっちの方が安いとBio-RadのAurum Total RNA Mini Kitに変え、我々もそれを使い始めたのですが、収量が少ない場合があって困っています。以前は少なくとも100ng/ul以上で回収できていたのが、最近は多くて100ng/ul、悪いと20-30ng/ul程度での収量になってしまっています（elutionに使うBufferの量は同じです）。 毎回「収量が少なくなってしまった」と報告してくるので、一度自分が見ている前で全工程をやってもらったのですが、特に問題があるようなことはしておりませんでした。 triplicateの場合に、二つのウェルでは50ng/ul以下、もう一つは100ng/ul程度、等ということもよくあります。回収前に細胞を顕微鏡下で観察しても、特に大きくコンフルエンシーが違うということもありませんでした。 そこで、キットの質がわるいのか？と疑っています。といって、そんなに質の悪いキットを名の通った企業が今時販売するか？とも思っていて、困っているところです。 同じような経験をされている方おられますか？また、Bio-RadのRNA抽出キットについて経験や情報をお持ちの方おられますか？どんなことでも良いのでお話が聞けたらと思っています。よろしくお願い致します。

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