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大腸菌コンピテントセル トピック削除
No.11334-TOPIC - 2023/04/04 (火) 14:48:28 - かつ
こんにちは。
大腸菌のコンピテントセルに関する質問です。
市販のDH5aを購入し、それからコンピテントセルを作成し、使い切りそうになったら、さらにそのコンピテントセルからコンピテントセルを作ろうとしたとき、継代を重ねるごとに形質転換効率は落ちていくものでしょうか。また、コンピテントセル化前のSOB培地での培養時間 (所定のODになるまでの時間) も長くなりますか。継代を重ねるごとに全体的に"元気"がなくなっていくでしょうか。
もし、経験があるかたがいましたら、お聞きしたいです。
よろしくお願いいたします。
　
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No.11334-6 - 2023/04/04 (火) 23:29:12 - おお
普通はへたることはないと私も思っています。ただし、中からちょっと変わった個体ができることは否定できないし、そういうのがドミナントになれば性質が変わったと感じるでしょう（大概はそういうのはほかのものより増殖が速いのでドミナントになるけど）。

そういう理由でコンピを作る際はすでに指摘があるようにまずはシングルでクローンをとりそこから増殖させ作るようにしています（２個コロニーをとって別々に増やして作っておくとはずれを引いたときのことを考えると安心です）。

上記のように通常は変なものがドミナントになるときは増殖が速いものが優位に立つので、増殖が落ちるというのはあまりなさそうですが（机上の空論かもしれません）、増殖が落ちるなど実際にした場合、培地、環境や器具に問題がなければもしかしたらファージのコンタミとか考えられるかもしれません。

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No.11334-5 - 2023/04/04 (火) 19:03:16 - G25
分裂が続けられる限り原核生物は「老化」しませんのでその心配は無用。
真核生物の培養細胞なんかだと継代による老化、劣化は常に意識しておかないといけないけれど。

DH5aの場合はそれほど心配しなくていいかもしれないけれど、宿主として必要な遺伝因子が継代中に「落ちる」ことは頻繁なので、これについては注意が必要。例えば青白選択やM13系ファージの宿主にするときに必要なF'因子など。本培養する前に最少培地や薬剤選択培地にstreak（画線培養）でして、生えてきたシングルコロニーを選択して培養を始める。

DH5aにはそういう落ちて困る因子はないけれど、やはり作法通りシングルコロニーから始めるのがいいでしょう。継代しているうちに違う菌株のコンタミ（例えばすでにプラスミドをもっている形質転換体）や自然変異の蓄積があるかもしれない　（例えばLacオペロンが壊れていて青白選択ができないのが混じっているかも）。シングルコロニーから始めれば、問題の無いクローンを拾ったならそれで良し、問題があったら別クローンでやり直すということができる。雑多なクローンが混じった状態でマスで培養して、いつ地雷を踏むかわからないというのが一番たちが悪い。

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No.11334-3 - 2023/04/04 (火) 17:22:33 - momo
最初の質問は同じストックに戻るのではなく植え継ぐという話ですよね。

よほど運が悪くなければ大丈夫だと思いますが、これを機会にコアのストックを作っておいたらどうですか？

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No.11334-2 - 2023/04/04 (火) 16:50:22 - AA
経験上ではなってないですね。
15年くらい前に購入したDH5aをから毎回画線培養して起こしてきていますが特に問題なく増えています。
（購入時に分注したので15年ずっと凍結融解というわけではないですがそれでも10回20回は凍結融解されてるんじゃないかと思います）

大腸菌コンピテントセル 削除/引用
No.11334-1 - 2023/04/04 (火) 14:48:28 - かつ
こんにちは。
大腸菌のコンピテントセルに関する質問です。
市販のDH5aを購入し、それからコンピテントセルを作成し、使い切りそうになったら、さらにそのコンピテントセルからコンピテントセルを作ろうとしたとき、継代を重ねるごとに形質転換効率は落ちていくものでしょうか。また、コンピテントセル化前のSOB培地での培養時間 (所定のODになるまでの時間) も長くなりますか。継代を重ねるごとに全体的に"元気"がなくなっていくでしょうか。
もし、経験があるかたがいましたら、お聞きしたいです。
よろしくお願いいたします。
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