BioTechnicalフォーラム [厚さの薄い組織の透明化]

厚さの薄い組織の透明化

No.11330-TOPIC - 2023/04/03 (月) 12:10:03 - 透明化

透明化試薬は組織丸ごとだったり、mm単位の比較的厚いサンプルに使用することが多いと思います。
ですが、私は300μm程度の厚さの組織を透明化して蛍光免疫染色により観察しようとしています。
そこで、下記疑問が出てきました。
・厚さが薄ければ透明化処理の時間は短縮できるのか？
・蛍光免疫染色を行う場合、透明化してから染色した方が良いのか、染色して透明化した方がいいのか？

透明化をなさっている方で上記問題に関する注意点などあれば教えていただけないでしょうか？
なお、試薬等は下記になります。
試薬：SCALEVIEW-S Trial Kit
組織：脳、心臓、肝臓、腎臓
厚さ：300μm

何卒お願い致します。
　

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No.11330-14 - 2023/07/14 (金) 20:57:14 - Karas

CUBIC-Histovision v1.0 は抗体染色に最適化しており、1-2mm厚は問題ありません。

透明化と免疫染色の相性が悪いという意見は事実です。各人で染色条件(温度、染色時間、抗体)を試行錯誤する必要があります。

ポイントは、幾つも抗体を用意して、温度と期間を振って試していくことです。CUBICは脳で開発されたので、抗体やその染色条件含め一番試しやすい臓器です。各臓器、各抗原毎に染めやすさは違います。

ただ私なら(1-2mm厚の脳、肺、心臓、肝臓、腎臓の透明化と蛍光免疫染色)はやりたくない、、、10um切片を100枚染色する方を選びます。理由は余りに大変、そして労力に見合った結果を期待しづらい。

透明化が必要なら蛍光タンパク質を発現している遺伝子組換え動物を使います。免疫染色が必要なら薄切します。透明化してかつ免疫染色しなければ分からないことというのは余り無い、というのが私の個人的な意見です。

(無題)

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No.11330-13 - 2023/07/14 (金) 19:05:16 - あの

抗体が深部まできちんと到達して
洗いも十分になるかどうかが、心配な点ですね。

(無題)

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No.11330-12 - 2023/07/14 (金) 13:17:19 - 24

類似項目で質問があるので、このトピックを使用させて下さい。

私はCUBICで各種臓器(脳、肺、心臓、肝臓、腎臓)の透明化と蛍光免疫染色を考えております。
なお、厚さは1から2mmのスライスの予定です。
ですが、透明化と免染は相性が悪いと聞いています。
透明化と免染を組み合わせる際に注意すべき事があればご教授願えないでしょうか？

よろしくお願い致します。

(無題)

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No.11330-10 - 2023/04/10 (月) 16:39:20 - AA

300um程度であれば透明化しなくても、という意見には賛成です。
一応透明化した場合の利点としては、やはり透明化しない場合よりもZスタック像は鮮明に得ることができます。

ただ、既に指摘のある通り透明化後の切片取り扱いが難しい点は注意が必要です。
脱脂後はかなり脆くなりますし、本当に見えなくなるくらい透明になるので壊さないように扱うのが大変です。
また、Scaleだと多少の切片の膨張も考慮する必要はあります。
観察に際しては透明化液中に沈めるのですが、液中で揺れないよう何らかの方法で押さえつける必要があります。
私はガラスボトムディッシュに液を入れて上からカバーガラスで押さえつけましたが、なれるまでは撮影中に動いてしまってきれいな絵になりませんでした。

(無題)

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No.11330-9 - 2023/04/10 (月) 16:28:39 - G25

whole mount ISH/IHCという手法があって、小さな生物、器官であればそのまま、そうでなくても適当なブロックに切り出した組織などを丸のまま染色、マウントして観察する方法があるくらいです（わざわざ「透明化」という特別な処理をしなくても）。それに比べて300 um切片がとくに困難ということはないように思います。

(無題)

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No.11330-8 - 2023/04/10 (月) 16:00:28 - toto

専用の試薬を使わなくても、1mm以下の切片なら普通に染めて（抗体が浸透できてるとして）、マウントするときにTDE(2,2'-Thiodiethanol)を使って載せれば、蛍光的に透明になりますよ。2000円くらいで買えるので遙かにお得です。
TDEはガラスの屈折率を持つ無害で安定な溶媒としてStefan Hellらが報告したものです。油浸オイルの代わりにも使えますが、マウント剤代わりにも使えます。

(無題)

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No.11330-6 - 2023/04/07 (金) 18:37:23 - Karas

ScaleVIEWは尿素とTritonX100ベースの試薬です。そのため、脱脂処理後に抗体を反応させ、その後に屈折率を合わせます。

プロトコルの詳細は公式サイトのAbScaleプロトコルを見て下さい
https://labchem-wako.fujifilm.com/jp/category/00593.html

1つ注意点としては、300um程度ですと本当に透明になってしまいハンドリングが非常に難しくなります。屈折率調整前にスライドに貼り付け、その後に調整液を載せていった方が良いです。

お勧めは
免疫染色用シールタイプC
このままカバーガラスを載せて封入出来ます

(無題)

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No.11330-5 - 2023/04/05 (水) 06:54:54 - あの

厚さ300umの切片って、固定しているのですか？
切片はどうやって切るのですか？クリオスットだと100umまでです。
観察はどうやってするのですか？

これらの要因も影響しますが、抗体が深部まできちんと到達して
洗いも十分になるかどうかが、心配な点ですね。

(無題)

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No.11330-4 - 2023/04/04 (火) 20:00:06 - 透明化

AAさん、G25さんアドバイスありがとうございます！
逆に透明化無しでできそうならそちらの方が色々応用が効きそうですね。
透明化せずそのままで蛍光免疫染色するとして、厚さや染色法で注意した方が良い点はありますか？
何卒お願い致します。

(無題)

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No.11330-3 - 2023/04/03 (月) 15:26:58 - G25

その試薬の特性はわからないのですが、
一般論として、免疫染色は標的の抗原性を保つために、染色前に余計な処理は加えないほうがよく、したがって染色してから透明化ではないでしょうか。また透明化は組織の屈折率を下げる組織に浸透させるというのが大きなポイントです。透明化してからさらに染色他のための処理をくわえると、試薬が抜けてもとに戻ってしまうかもしれないし、浸透した透明化試薬によって染色や洗浄が妨げられるかもしれない。

それと厚さ300 um程度の切片であれば、いわゆる「透明化」試つかわかわなくても、普通のmountantでも行けそうな気がする。

(無題)

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No.11330-2 - 2023/04/03 (月) 14:36:37 - AA

>>・厚さが薄ければ透明化処理の時間は短縮できるのか？
当然短縮できます。具体的にどの程度に短縮するかはご自身のサンプルで検討されることを強く奨めます。

>>・蛍光免疫染色を行う場合、透明化してから染色した方が良いのか、染色して透明化した方がいいのか？
たいてい脱脂と屈折率調整の間で染色するケースが多いのではないかと思います。
厚さ300um程度なら普通に染められそうなのでどっちでも良いのかもしれません。

厚さの薄い組織の透明化

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No.11330-1 - 2023/04/03 (月) 12:10:03 - 透明化

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