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(無題) 削除/引用 No.11329-17 - 2023/04/06 (木) 09:46:29 - おお LiClはRNA精製で、溶液から沈殿させるのにも使いますね。ただ、100bとか短いものは沈殿しないのでちょっと書こうかどうか悩みなした。まあカラムでも短いものは回収できないんですけどね。

(無題) 削除/引用 No.11329-16 - 2023/04/05 (水) 17:54:05 - G25 質問には関係ないですが、 AGPC法で組織由来のグリコゲンの夾雑が問題になる場合、 IPA沈殿のステップでグリコゲンの共沈を軽減するために、クエン酸を主成分とする「RNA precipitation solution」を加え、その代わりIPAの量を減らすといオプションがあります。近年ではTrizolほか市販のAGPC試薬の説明書にも記載されるようになっています。 また、古典的にはアルコール沈殿したRNA pptを2 M LiClに再懸濁（ペッスルなんかでホモジナイズ）してから遠心して、RNAをpptとして再回収し、多糖類を残した上清を除去するという方法があります。

(無題) 削除/引用 No.11329-15 - 2023/04/05 (水) 12:16:21 - s おお様 追記ありがとうございます。 いつも有益な情報をご教示してくださり感謝申し上げます。

(無題) 削除/引用 No.11329-14 - 2023/04/04 (火) 01:48:48 - おお TRizolなどで精製するときは、肝臓などがグリコーゲンなどが除けず問題になることがあります。メラノーマではメラニンの混入がPCR阻害物質となり除去の必要があるとも聞きます。 両社の場合CTABをつかう方法は有効と思ってます。 細胞がどういう種類かによって解決方法がすでに確立していたりもしますので、問題が解決しなさそうで、開示できるのであれば、そうされるといいでしょう。

(無題) 削除/引用 No.11329-13 - 2023/04/03 (月) 14:15:22 - s みなさま ご指摘ありがとうございます。 色々な方法を試してみたいと思います。

(無題) 削除/引用 No.11329-12 - 2023/04/03 (月) 13:08:48 - おお >260/230が極端に低くなる 指摘がありますようにグアニジンのCarry overの可能性があります。それならサンプルをエタチンして溶出用バッファーで再度溶かせばげ難なく解決するでしょう。しかしながら、同じ組織で必ずおこるとなると事情が違うかも知れないとも思いましたので最初に書いたような方法を示しました。エタチンで解決できないないなら、もっと単純には溶出したさんぷるにもう一度RLT加えてからむにかけるだけでも解決する可能性があると思います。

(無題) 削除/引用 No.11329-11 - 2023/04/03 (月) 11:28:15 - G25 >どのような細胞種が「良い」、あるいは「悪い」のか 細胞種にによって一定の傾向があるなら、細胞種ごとの性質によるものと考えるべきでしょう。 例えば、貯蔵脂質が多いとか、カロテン、メラニンのような色素を含むとか。あるいはRNase活性が高くて実は分解気味（材料種によってはありがち）というのが主原因で、RNA吸光が下がる分、OD260/280 ratioが低くなっているとか。

Abs(230nm)高値対策 削除/引用 No.11329-10 - 2023/04/03 (月) 09:39:42 - ふみ ウォッシュ回数を1回増やすとマシになります。

(無題) 削除/引用 No.11329-9 - 2023/04/03 (月) 09:07:36 - 2ME https://www.qiagen.com/ja-jp/resources/faq?id=c59936fb-4f1e-4191-9c16-ff083cb24574 "What are the effects of low A260/A230 ratios in RNA preparations on downstream applications?" "In our experience, the increased absorbance at 230 nm in RNA samples is almost always due to contamination with guanidine thiocyanate, present at very high concentrations in the lysis buffer or extraction reagent used in most RNA purification procedures."

(無題) 削除/引用 No.11329-8 - 2023/04/03 (月) 08:35:53 - s みなさま ご指摘ありがとうございます。 論文の件は参考になりました。 質については、細胞腫によってはRNA抽出後、その濃度を測定すると 260/230が極端に低くなることがあって困っていた状況です。

(無題) 削除/引用 No.11329-7 - 2023/04/03 (月) 08:07:10 - あの とれる量が少ないという意味ではなく？

(無題) 削除/引用 No.11329-6 - 2023/04/03 (月) 07:29:25 - G25 どのような細胞種が「良い」、あるいは「悪い」のか

(無題) 削除/引用 No.11329-5 - 2023/04/03 (月) 07:27:59 - G25 > RNAの質がよいものと悪いものがあります どのようなクライテリアをどういう手段で評価したのか？ 泳動、バイオアナライザ、OD比,,, RNAの分解、DNAなどの混入、RIN,,,

(無題) 削除/引用 No.11329-4 - 2023/04/03 (月) 06:00:34 - おお https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC2813910/ なんか組み合わせるといいかと思う。 クロロフォルムなど上記の方法で使っているけど、省略して、沈殿させた物をRLTで溶かすぐらいでも結構精製度は上がりそうだが、もしかしたら溶けにくいかもしれない。 他にはTRIZOLでクロロフォルム加えて遠心した後の水層にイソプロを加え、遠心せずにQIAGENカラムに乗せるというのもあるけど、精製で混じってくる物によってはあまり効果がないかも。

(無題) 削除/引用 No.11329-3 - 2023/04/03 (月) 03:31:11 - s おお様 ご返事ありがとうございます。 QiagenのRNeasy kits (https://www.qiagen.com/ja-us/products/discovery-and-translational-research/dna-rna-purification/rna-purification/total-rna/rneasy-kits?catno=74104) です。

(無題) 削除/引用 No.11329-2 - 2023/04/03 (月) 03:23:22 - おお RNA精製キットの商品名は？

RNA抽出 削除/引用 No.11329-1 - 2023/04/03 (月) 02:57:21 - s 培養細胞からRNAを抽出するときに、 細胞腫によって、RNAの質がよいものと悪いものがあります。 プロトコールは PBS wash, RLT+70%EtOHピペッテイング後遠心, REW1遠心,RPEx2遠心, RNase H2O遠心で回収 です。 そのようなときの対策はなにかないでしょうか？

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