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(無題) 削除/引用 No.11318-6 - 2023/04/01 (土) 21:02:50 - べいべい 小中学校の理科実験でやってる方法です。 http://ymorita.la.coocan.jp/DNAext.htm PCRがかかれば良いだけなら考え過ぎなくていいと思うけど。

(無題) 削除/引用 No.11318-5 - 2023/03/31 (金) 08:55:10 - トンキン G25さん ありがとうございます！ TESにProKを入れる系はTrisのpHが8.0ですが、その通りやっております。 NH4OAcの植物系の文献を見ていると標準的に終夜、早いものでも数時間を推奨していたのでその程度かと思っていました。 5分で大丈夫というのはかなり驚きでした。 クロロホルムを使えないので、まずはNH4OAcのみで。 早速試してみたいと思います。 おおさん ありがとうございます。 イソプロ沈殿のところは、同様に竹串にからめとって70％エタノールで洗浄しています。 有機物の分画でつかったと思われる古いシリカの粉末がありますので、時間のある時にグアニジン塩酸を使って吸着する系を試してみたいと思います。

(無題) 削除/引用 No.11318-4 - 2023/03/30 (木) 16:37:46 - おお 6Mぐらいの尿素存在下で酢酸ナトリウムなど使ってエタチンすると結構タンパクは除ける。グラスビーズ(シリカ、グラスミルク)が有ればグアニジン存在下で吸着させるのもありだし、もっとシンプルなのはイソプロチンで遠心せず、糸状になったDNAをガラスのパスツールピペットで巻き取り、そのDNAを70％エタノールにピッペットの先ごとつけてあらい、最後にTEの中につけて溶けるのを待つ。

(無題) 削除/引用 No.11318-3 - 2023/03/30 (木) 16:09:22 - G25 NH4OAcあるいはKOAcでタンパク質を塩析してゲノムDNAを精製する方法は、動物でも細菌でもファージでもSDSを含んだlysateなら適用できます。Alkali/SDSでプラスミドを取るときの塩析も仕組みは一緒（ただしAlkali変性されたゲノムDNAはタンパク質と一緒に塩析）。 >4℃で終夜インキュベートするステップが そんなにする必要ない。Alkali/SDSの塩析と同じくらいの感覚。 1. サンプルを10-20 vol程度のTES (0.1 M Tris-HCl, pH 9/0.1 MEDTA/ 1% SDS)中でホモジナイズして、70℃, 20 min。 または、終濃度1 mg/mLのProKを加えて55℃, >=30 min (材料に応じて）。 2. 1/2 vol 7.5 M NH4OAc （と沈殿しやすくするために少量のCHCl3)を混合して氷水浴 >=5 min. 3. 4℃、高速で適当な時間（volumeや材料により加減）遠心して、上清を回収。アルコール沈殿。

マウス肝臓からのDNA抽出時にフェノクロを使わない除タンパク 削除/引用 No.11318-1 - 2023/03/30 (木) 15:05:58 - トンキン マウスのある遺伝子のゲノム配列をPCRで取得するためにその鋳型となるゲノムDNAの抽出を行っています。 ラボの方針でフェノクロの使用がNGで、P社のProtein precipitation Bufferを使って除タンパクしています。 しかし、現在、Protein precipitation bufferが切れてしまい、予算が執行される来年まで購入することが出来ません。 マウスの肝臓からフェノクロのステップを省略して抽出したゲノムDNAをPCRにかけてみたのですが、ターゲットの分子量と若干異なる+エキストラが多数出ています（過去のPCRではシングルの増幅断片が得られていた）。プライマーが古いのでその可能性もあるとおもうのですが、まずはゲノムDNAの質を上げてPCRをして再現が取れるか確認するよう指導されています。 どなたか、Protein　Precipitaiton Bufferの代替になりそうな試薬の組成が記載されている文献をご教示いただけませんでしょうか？ 試薬はそれなりにあるラボ（または試薬はほかのラボからもらうなり出来そう）です。 また、植物系のゲノムDNA抽出の時に7.5M酢酸アンモニウムで除タンパクする実験系は見つけました。 7.5M酢酸アンモニウムを加えて4℃で終夜インキュベートするステップがあるようですが、これを動物組織にも応用できるものでしょうか？

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