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ビオチン化では 削除/引用 No.1130-8 - 2012/11/16 (金) 20:12:01 - ema Ｂｉｏ化は私自身はキットですらなく古典方法で単なるＢｉｏｔｉｎ（ｓｉｇｍａ）の粉を混ぜて反応させ透析でバッファー交換してＯＫでした。 標識後のチェックを行い、細胞、、、だと面倒でしたので、Ｗｅｓｔｅｒｎに使うＰＶＤＦメンブレンに本当に少量スポットして（希釈しての減衰確認とＢｕｆｆｅｒのネガコン、すでにＯＫなＢｉｏ抗体ポジコン）にＳｔＡｖ-ＨＲＰを持っていたのでＥＣＬでさくっと判定していました。 ビオチンｰＳｔＡｖで検出する場合には非特異（ＳｔＡｖがひっかける）が逆に増えてきたなくなる可能でがあるのでＦｃレセプター抗体（2.4Ｇ2）でのマスキングは必ずしています。

(無題) 削除/引用 No.1130-7 - 2012/11/15 (木) 13:28:25 - セルトリ ema様 ご助言ありがとうございます。 >2次抗体はanti-rat conjugate Alexa647という理解でよいでしょうか? はい。上記とまったく同じものになります。 >この実験の時には１次抗体のrat abをビオチン化して、２次抗体はStAv-(ここは何をつかったのでしょう；StAv-Alexa647かなにかもってらっしゃるのですか?他の色素でもいいですが） ご指摘の手順で染色を行いました。二次抗体は同じくミルテニーで推奨されているanti-biotin-APCを使用しました。 647でなければいけない理由はないので、赤色の波長でも検討してみようかと思います。 ただ、今回行ったビオチン標識がまったく反応しなかったので困っている状態です。

もうちょっと確認 削除/引用 No.1130-6 - 2012/11/15 (木) 11:34:33 - ema ＞二次抗体にはAlexa647を使用しております。 ＞一次抗体はラットモノクロを使用しております。 ということは2次抗体はanti-rat conjugate Alexa647という理解でよいでしょうか? ＞ミルテニーのワンステップビオチン標識キットなるものを使ってみたのですが、そしたら全くシグナルを検出できませんでした。 この実験の時には１次抗体のrat abをビオチン化して、２次抗体はStAv-(ここは何をつかったのでしょう；StAv-Alexa647かなにかもってらっしゃるのですか?他の色素でもいいですが） ということですよね。 色素的にAlexa647（=Cy5と似ている；青）を選択したのは理由がありますか？ （他の色は他の抗体で使ってしまっているとかの） 単純に言うと赤の方がS/N比等で光強度（インテンシティ）が高く設定できます。

(無題) 削除/引用 No.1130-5 - 2012/11/14 (水) 15:19:30 - セルトリ ema様 適格なご助言ありがとうございます。 ご指摘の通り陽性細胞集団の割合が少なく、かつシグナルも弱いのでゲートの取り方には問題があるかと思います。 二次抗体にはAlexa647を使用しております。 とりあえずシグナルを上げれば陽性細胞集団のゲートがしっかりとれるのではないかと思いミルテニーのワンステップビオチン標識キットなるものを使ってみたのですが、そしたら全くシグナルを検出できませんでした。 何かシグナルを強くする良い方法やキットをご存知ないでしょうか？ 一次抗体はラットモノクロを使用しております。

ソートしたと言いますが 削除/引用 No.1130-4 - 2012/11/12 (月) 10:58:36 - ema ＞高発現(>60%)の細胞集団を回収するのと、低発現(<10%)の細胞集団を回収するのとではソーティングの分離能は変わって 変わります。 また抗体のインテンシティと発現量の問題は全く異なる次元のお話です。 インテンシティの問題でしたら ＞ビオチン化標識でシグナル強度を高める は解決しますが、発現量が多くなることはありません。 抗体退色、もしくははずれているをまず疑うのはなぜでしょう？ ソート後培養したわけでもないのに私はそのような現象にあったことはありません。 ソートは結局こちらがposiであると判定した領域を別ストリームで分けていくのですが、ソーター自体のストリーム分離能力は大丈夫ですか?少量しか発現していないのでストリーム速度を強くしてソート時間の短縮をはかると分離は悪くなります。 また、低発現で判りにくいとかもったいないからとゲートを広く取っていませんか? 現在何色でソートをかけているのでしょうか。 もし1色（1種類の抗体で大まかな分離を行えるなら）である程度の分離判定がなされるなら、その1抗体をMACS等のビーズで濃縮し％をあげ、その後色素の複数抗体でソートすると、高発現のときのソートと変わりないことができないでしょうか？

(無題) 削除/引用 No.1130-3 - 2012/11/11 (日) 11:13:49 - ~ そもそも問題は起きているのでしょうか？ 低発現集団から回収された、細胞の目的タンパク質の発現量はどうなっているのでしょうか？ ・FACS中の抗体のかい離を疑っている 回収後の細胞集団を再度抗体染色してから流すことで、抗体のかい離の影響を確認できるでしょう。 蛍光物質の退色もこれである程度は復活するかもしれません。 ・FACS自体が分離をきちんとできていないことを疑っている 蛍光ビーズを2種類用意し、ブレンド比を変えてソーティングすることで、 多量の目的外のビーズの中から、目的のビーズがきちんと回収できるかが確認できるのではないでしょうか。

(無題) 削除/引用 No.1130-2 - 2012/11/10 (土) 10:02:32 - おお ソーティングに関して詳しくないのですが、 再解析の時に見ている蛍光強度のスケール、感度は一緒ですか? 2回めで、10%未満のシグナルのえられた細胞集団の50%が10%の蛍光強度を超えていたとするなら、色素の退色とかではないですよね。強くなっているのですから。 >抗体の切れ味が悪い イメージがわかないですけど。

FACSソーティングの純度 削除/引用 No.1130-1 - 2012/11/10 (土) 09:44:18 - セルトリ いつも参考にさせていただいております。 今回ご質問させていただきたいのではソーティング後の細胞の純度についてです。 高発現(>60%)の細胞集団を回収するのと、低発現(<10%)の細胞集団を回収するのとではソーティングの分離能は変わってくるのでしょうか。 これまではソーティング後にqPCRなどで目的細胞集団が濃縮されているのを確認していたのですが、ソーティング直後にFACSで再解析を行うといまいちな感じです。 高発現したものを再解析すると80%以上濃縮されているのですが、低発現だと50%ぐらいです。まぁそれでも濃縮はされているのですが、いまいちすっきりしません。 こういう時の考え方としては、抗体の切れ味が悪い、再解析するまでに色素が退色してるなどが一般的でしょうか。 また、抗体の切れ味(PC上でのプロット)自体は悪くないとは思うのですが、蛍光強度があまり高くはないです。 上記のような問題点を克服する際に何かいい方法などございましたらアドバイスをいただけないでしょうか。 最近ビオチン化標識でシグナル強度を高める方法があることを知ったのですが、これによってソーティング効率が劇的に増加したなど、体験談などもあればお教えいただけると幸いです。

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