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(無題) 削除/引用 No.11297-19 - 2023/04/04 (火) 10:35:16 - LPS みなさん、色々、解決策を挙げていただきありがとうございます。もっと早く相談しておけばよかったです。 タンクを使ってウェットでやってたりもしてたんです（タンクでもくっつくことはありますね）が、turbo blotを導入してから、その簡便さに負けてしまいました。ゲルの接着さえ起きなければ、ちゃんと検出できていたというのも言い訳です。 転写が７分−１０分で終わるので、転写時には、TBSTを入れたカセットを用意して、すぐに移せるようにはしています。ゲルは全てが転写用のカセットにアッセンブルされた状態で、剥がしますし、ゲルの方から剥がしていくので乾いていくことはないのじゃないかとは思います。 転写電圧を下げて、温度が上がらないようにするというのは魅力的なんですが、ほとんど全ての転写を７分のプログラムでやっていて、人数の割に、ブロッターはその速さ故に、一台しかなくて、３０分で流すのはややはばかれるところがあるんですが、うまくいくようなら仕方がありません。 今回、色々と案を出していただいたので、次回の転写が楽しみです。

(無題) 削除/引用 No.11297-18 - 2023/04/04 (火) 07:33:17 - mont カセットを開けてからメンブレンを取り出すまでの時間が、長すぎるんじゃないでしょうか。 お使いのプロトコールにもよりますが、TGXゲル用のターボプロトコールだと、カセット内がかなり熱くなります。メンブレンとゲルが表面に露出した状態でもたもたしていると、あっという間にゲル表面が乾いてきて、メンブレンに張り付きやすくなります。特にウェルの足部分は乾くのが早く（空気に触れる表面積が大きいから）、高分子側がメンブレンに張り付く原因になりやすいです。 なので、私は、カセットを開ける前にDWを入れたタッパーとピンセットを用意し、心の準備をし（笑）、カセットを開けたら速攻で（数秒で）メンブレンをDWに移すようにしています。で、熱でカセットが乾く前に、すぐにDWでカセットを洗浄し、その後にメンブレンの処理をします。 PVDFメンブレンなので、ニトロセルロースより丈夫で割と乱暴に扱っても大丈夫とか、張り付き難いとか、あるのかもしれませんが。 カセットを開けた後にもたもたしてしまうなら（ときどきメンブレンをうまく掴めなかったり、どこにあるのかわからなかったりします）、DWを入れた大きめのタッパーに濾紙やゲルごとドボンとしてから、ゆっくりメンブレンを探しても良いかな、とも思います。 とにかく、ゲルとメンブレンを乾かさないように注意してみてはどうでしょうか。

(無題) 削除/引用 No.11297-17 - 2023/04/04 (火) 06:05:41 - たこ助 >[Re:16] あのさんは書きました : > たこ助さん > > ありがとうございます。 > > 後輩の方が作っていたゲル濃度をご存じでしたら、教えてください。 > > よろしくお願いします。 6%, 5%, 4%の3種類でやっていましたが、いずれも問題なく上手くできていたと記憶しております。

(無題) 削除/引用 No.11297-16 - 2023/04/04 (火) 02:07:31 - あの たこ助さん ありがとうございます。 後輩の方が作っていたゲル濃度をご存じでしたら、教えてください。 よろしくお願いします。

(無題) 削除/引用 No.11297-15 - 2023/04/03 (月) 23:36:33 - たこ助 >[Re:14] あのさんは書きました : > 便乗質問です。 > > Transblot turboで、turbo を選ぶと、2.5アンペアの定電圧で７分がデフォルトだったと思います。 > > これを使わずに、 > > 編集機能を使って、1アンペアの定電圧で30分にすれば、発熱を減らせて、350kDa高分子ぐらいのトランスファーできないかと考えています。トピ主さんのような問題も生じずに。 > > > 実際に試したことのある方がいらっしゃれば、御経験の結果を教えてください。 高分子屋の後輩がやっていました。 Bioradのプレパックのものは高くて使えなかったので、自作ゲル&ワットマン濾紙でやっていました。 確かそのような条件に編集してやっていた記憶がありますが、うまくいっていたようですよ。 自身の経験ではないですがご参考になれば幸いです。

(無題) 削除/引用 No.11297-14 - 2023/04/03 (月) 20:41:57 - あの 便乗質問です。 Transblot turboで、turbo を選ぶと、2.5アンペアの定電圧で７分がデフォルトだったと思います。 これを使わずに、 編集機能を使って、1アンペアの定電圧で30分にすれば、発熱を減らせて、350kDa高分子ぐらいのトランスファーできないかと考えています。トピ主さんのような問題も生じずに。 実際に試したことのある方がいらっしゃれば、御経験の結果を教えてください。

(無題) 削除/引用 No.11297-13 - 2023/04/03 (月) 01:17:27 - たこ助 400から800 kDaくらいのをよくみてましたが、すでに出ているように ・ゲルを転写前に数分transfer bufferに浸す ・濾紙は薄め で特に問題なく見れていました。 濾紙はワットマンのもの(型番失念)を使用していました。 Bioradの分厚い１枚よりだいぶ薄かったです。 それでもくっついた場合はDDWの洗瓶で高圧洗浄で吹き飛ばしていました。 ECLでも特にゲル片由来の黒点は出てきていませんでした。 本題からは外れるかもしれませんが ・Transblot turboだとくっつく事象が多かった気がして、高分子の検出には使用していませんでした。 ・あと、Wetじゃだめでしょうか？機材がなければ仕方ないですが、高分子を扱うチームの人には結構そちらを使う人が多かったように思います。

(無題) 削除/引用 No.11297-12 - 2023/04/01 (土) 12:50:09 - あの ちなみにPVDFです。

(無題) 削除/引用 No.11297-11 - 2023/04/01 (土) 12:25:44 - あの 当方では、同様にバイオラド製品を使っています。 コールドルームではなくて室温で、TBSを使って洗っています。 レシプロ式ですが、シェーカーの速度を極力　早くすれば、ゲル片は、とれます。

(無題) 削除/引用 No.11297-10 - 2023/03/29 (水) 07:18:49 - LPS ありがとございます。 転写後、コールドルームでTBSTで揺すったことがあるのですが、改善はされる傾向があったんですが、それでも残ってしまうのがかなりあって、ここに相談させてもらいました。 AnyKD、面白いですよね。自分のターゲットは250KDなので、このゲルのレンジからは外れてるんです。ですが、3-8%のゲルなるものを見つけたので、届き次第試してみようと思います。ゲルの濃度はさらに低いですが、中央部寄りまで流せて、接着しやすい部分を回避できればと思います。

(無題) 削除/引用 No.11297-9 - 2023/03/25 (土) 11:07:54 - 1 転写終了後にゲルと膜を無理にはなさずに一体のまま、十分な量の水もしくは適当なbufferの中につけて振盪してみてください。徐々に剥がれるように思います。

(無題) 削除/引用 No.11297-8 - 2023/03/25 (土) 10:33:55 - あの こんなやつ https://www.bio-rad.com/ja-jp/sku/4569033-any-kd-mini-protean-tgx-precast-protein-gels-10-well-30-ul?ID=4569033

(無題) 削除/引用 No.11297-7 - 2023/03/25 (土) 05:34:35 - あの バイオラドのゲルを使っているなら、anykd などの他のゲルに代えるのは できませんか？

(無題) 削除/引用 No.11297-6 - 2023/03/25 (土) 00:39:57 - LPS 濾紙もキットに込みで、1回分ごとに分けられています。セミドライなので、濾紙は減らしたくはないのですが、考えてみます。

(無題) 削除/引用 No.11297-5 - 2023/03/25 (土) 00:37:15 - LPS アドバイス　ありがとうございます。 転写バッファーはBioRadのものですが、20%エタノールを加えて使用するのですが、泡が立つので、何らかの界面活性剤は添加されているようです。 転写後、明らかに乾いている様子はありませんが、ベトベトでもありません。カセットを閉めた時に設定の高さで押されるので、バッファの保持量を大きく増やす事はできないのですが、量を増やすように試みてみたいと思います。ただ、濾紙を増やすことは、カセットの高さは調節できないので、圧をさらに増やすことにもなり試していません。 メンブレンは転写前には、転写液の中に浸しています。

(無題) 削除/引用 No.11297-4 - 2023/03/24 (金) 14:25:12 - 1 transfer bufferが不足で乾きかかってませんか。

(無題) 削除/引用 No.11297-3 - 2023/03/24 (金) 13:38:18 - toto 濾紙が少し想定よりも厚いとか。それならば1枚減らしてみては。

(無題) 削除/引用 No.11297-2 - 2023/03/24 (金) 02:13:25 - おお 確かにゆるいゲルはくっつきやすいというのはありますね。あまり好きではないですが、ゲルをTransfer用バッファー（メタノール入り）に数分つけてからTransferしてみてはどうでしょうか。メタノールの影響でゲルがちょっと縮み固くなるかなと（勝手に想像しているのですが）。 メタノールの影響でTransferされにくいものが出てくるかもしれませんけど、一応そのようにするプロトコールもあるようです。きになるならゲルを浸すときにTransferバッファーに若干のSDSを入れておくてもなくはないです。

セミドライブロットでのゲル接着 削除/引用 No.11297-1 - 2023/03/24 (金) 00:42:32 - LPS セミドライブロッターで転写後、ゲルの接着が結構起こります。 当方は4-15%precast を使用しているのですが、高分子側で起こり、ターゲットがそのあたりなので困っています。膜はニトロセルロースです。バイオラッドの機材、消耗品を使用しているので、バイオラッドに問い合わせしたのですが、具体的な解決策はありませんでした。 何か良い解決策があれば、是非教えていただきたいです。

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