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(無題) 削除/引用 No.11289-13 - 2023/03/23 (木) 15:40:34 - TS 他の人も書かれていますが、16SrRNAを標的にしたメタゲノム解析でも定量PCRでも特段問題にはならないと思います。糞中の菌叢解析でも山ほどホストのDNAが含まれています（たぶん大部分が腸管上皮由来）。

(無題) 削除/引用 No.11289-12 - 2023/03/23 (木) 15:36:50 - Ca G25様 benzonaseはgDNAだけでなく、mtDNAの除去にも有効とのこと、承知しました。 ありがとうございます。

(無題) 削除/引用 No.11289-11 - 2023/03/23 (木) 11:18:02 - G25 蛇足ですが、 >宿主細胞のみがlysisする条件でbenzonaseを使用する方法 はgDNAだけでなくmtDNAの除去にも有効です。

(無題) 削除/引用 No.11289-10 - 2023/03/23 (木) 09:32:56 - G25 >ふんなどからMicrobiomeを見るときはミトコンドリアのゲノムとか混じってそうだけど取り除いたりしてはないような気がするのですが、 mtDNAは邪魔になるけど多くの場合、大きな支障にならず、 リードをソフトウェア的にフィルターすることで対処されていると思います。 ただサンプルによっては（例えば腸粘膜とか）かなりのリード数がミトコンドリア由来で食われてしまうことがあって、歩留まりが悪くなったりします。

(無題) 削除/引用 No.11289-9 - 2023/03/23 (木) 09:28:26 - Ca おお様、G25様 お返事ありがとうございます。 細胞を破壊してDNAを露出させた段階では宿主DNAと細菌DNAの分離は不可能であり、 現状としては、細胞の段階で分離するか、宿主細胞のみがlysisする条件でbenzonaseを使用する方法 が考えられるということで承知しました。 benzonaseを使用する方法をまずは試してみようと思います。 また、重ねての質問にはなりますが、細菌DNA分離後はPCRを行おうと考えています。そこで、ヒトゲノムDNAはもちろんですが、mtDNAが夾雑物として混入していた場合、PCRに干渉する可能性はありますでしょうか。 重ね重ねの質問にはなりますが、何卒よろしくお願い申し上げます。

(無題) 削除/引用 No.11289-8 - 2023/03/23 (木) 02:50:54 - おお >[Re:7] G25さんは書きました : > >全ゲノムを対象としたメタゲノム解析では宿主ゲノムの夾雑がクリティカルなので、 > > > 16S rRNAメタゲノムのときは原核生物特異的プライマーでPCRかけるから大丈夫と思いきや、宿主細胞由来のmtDNAの夾雑が邪魔になります。 ふんなどからMicrobiomeを見るときはミトコンドリアのゲノムとか混じってそうだけど取り除いたりしてはないような気がするのですが、ポピュレーションが圧倒的ということなんでしょうか。

(無題) 削除/引用 No.11289-7 - 2023/03/22 (水) 19:11:42 - G25 >全ゲノムを対象としたメタゲノム解析では宿主ゲノムの夾雑がクリティカルなので、 16S rRNAメタゲノムのときは原核生物特異的プライマーでPCRかけるから大丈夫と思いきや、宿主細胞由来のmtDNAの夾雑が邪魔になります。

(無題) 削除/引用 No.11289-6 - 2023/03/22 (水) 18:25:15 - G25 DNAにしてしまったら、宿主由来と細菌由来を分離するのは不可能と言っていいでしょう。 かと言って、細胞の形で宿主細胞と細菌を分離するのもまた難しいような気がしています。遠心分離で分ける？　細胞表面抗原に対する抗体かなにかで分ける？　でも、頬粘膜の顕微鏡観察なんかすると、細菌の多くは細胞表面にぺったりくっついているように見えます。宿主細胞を除去するとくっつきやすい細菌も選択的に除去されてバイアスがかかりそうな。 やっぱり細胞膜を持たない宿主細胞のみがlysisする条件でbenzonase (ヌクレアーゼ)を効かせるくらいしか思い浮かばない。

(無題) 削除/引用 No.11289-5 - 2023/03/22 (水) 17:35:54 - おお >[Re:3] Caさんは書きました : > seventh様 > お返事ありがとうございます。 > > 分離というのは、ゲノムDNA特異的にどのような方法で行うのでしょうか。 > 無知で申し訳ございません。 > > ふと思いついた案としては、固相にゲノムDNAのみと相補的なプライマーを固定し、その固相とゲノムDNAが入っている溶液を接触されることで分離できるのかなと思いました。 > > ご教示いただけますと幸いです。 > よろしくお願い申し上げます。 おそらく、ゲノムというよりは、細胞の段階で分離するという話だと思います。口腔上皮細胞は、細胞死を伴わず剥離するので、細胞を除けばと言うことでは無いでしょうか。死んで断片かしてないならサイズでも分けられそうな気もするし。ただ死細胞などのデブリが全くない保証はないですが。

(無題) 削除/引用 No.11289-4 - 2023/03/22 (水) 17:17:50 - G25 宿主由来の核酸をBenzonaseで消化する方法があると思います。 インタクトな細菌は細胞膜、細胞壁、外膜や莢膜に包まれているのでゲノムDNAはBenzonaseから保護されます（したがって、凍結保存などで細菌の破損をきたしたサンプルには不向き）。 全ゲノムを対象としたメタゲノム解析では宿主ゲノムの夾雑がクリティカルなので、除去する手立ては当然、考案されているはずですね。私が知っているのは、使用経験のあるQIAamp DNA Microbiome Kitで採用されているBenzonase を使う方法だけですけど、ほかにもあるかもしれない。 https://www.qiagen.com/ja-us/products/discovery-and-translational-research/dna-rna-purification/dna-purification/microbial-dna/qiaamp-dna-microbiome-kit

(無題) 削除/引用 No.11289-3 - 2023/03/22 (水) 16:34:57 - Ca seventh様 お返事ありがとうございます。 分離というのは、ゲノムDNA特異的にどのような方法で行うのでしょうか。 無知で申し訳ございません。 ふと思いついた案としては、固相にゲノムDNAのみと相補的なプライマーを固定し、その固相とゲノムDNAが入っている溶液を接触されることで分離できるのかなと思いました。 ご教示いただけますと幸いです。 よろしくお願い申し上げます。

(無題) 削除/引用 No.11289-2 - 2023/03/22 (水) 16:17:25 - seventh 抽出前に分離した方が良いのでは。

ゲノムDNA特異的に捕捉する方法 削除/引用 No.11289-1 - 2023/03/22 (水) 16:09:25 - Ca いつも勉強させていただいています。 口腔内の細菌DNAを調べようとしています。そのために、まずは口腔内細菌のDNAを回収しようとしています。DNAの回収方法として、口腔内をスワブで拭い、そのスワブをグアニジン溶液に入れてカオトロピック効果を利用してDNAのみの回収を試みています。 しかし、やはり口腔上皮細胞もぬぐった段階で混入し、ヒトゲノムDNAもDNA回収時に混ざってしまうようです。 そこで、一般的な方法で構いませんので、もしあればヒトゲノムDNA特異的に除去する方法はありますでしょうか。 同じ核酸なので、そんな方法ないと思っているところでもあり、なければないと、はっきりおっしゃっていただければ幸いです。 何卒よろしくお願い申し上げます。

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