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pLL3.7プラスミドについて トピック削除
No.11282-TOPIC - 2023/03/20 (月) 15:53:18 - RNAi
いつも勉強させていただいております。

アドジーンからpLL3.7プラスミドを購入しまして、これから初めてshRNA実験を行えたらと考えています。
そのページにクローニング方法について説明があり、以下のように書かれてありました。
ttps://media.addgene.org/data/94/67/16242780-af64-11e0-90fe-003048dd6500.pdf

"Sense oligo: An HpaI site leaves a blunt end prior to the –1 position in the promoter. The sense oligo design must incorporate a 5’ T in order to reconstitute the –1 nucleotide of U6. An XhoI site cuts downstream of the U6 start site."

"Antisense oligo: Compliment of sense but with additional nucleotides at 5’ end to generate XhoI overhang."

とあり、
センス鎖は以下のようになる、と書かれてありました。
5’T-(GN18)-(TTCAAGAGA)-(81NC)-TTTTTTC 3’

これに関して２つ質問をさせてください。

１. shRNAの標的検索ツールで得られる候補shRNA配列は18塩基ではなく、21塩基で返ってきてしまう。この場合、上記プラスミドのNが21になってもいいのかどうか？また18に設定できるようなツールサイトはありますでしょうか？

2. アンチセンスの配列としては次の２つのうち、どちらが正しいでしょうか？
3’A-(CN18)-(AAGTTCTCT)-(81NG)-AAAAAAGGAGCT 5’　または
3’A-(CN18)-(AAGTTCTCT)-(81NG)-AAAAAAGAGCT 5’　か。

shRNAプラスミド構築は初めてで大変初歩的でかつ稚拙な文章になってしまい分かりづらくなっているかと思いますが、どうかご教示いただけますと幸いです。
　
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(無題) 削除/引用
No.11282-2 - 2023/03/29 (水) 17:20:48 - Kras
既に解決済かもですが分かる範囲で答えます。

１. Nが21になってもいいのか？
→大丈夫

2. アンチセンスの配列は
3’A-(CN18)-(AAGTTCTCT)-(81NG)-AAAAAAGAGCT 5’　

pLL3.7プラスミドについて 削除/引用
No.11282-1 - 2023/03/20 (月) 15:53:18 - RNAi
いつも勉強させていただいております。

アドジーンからpLL3.7プラスミドを購入しまして、これから初めてshRNA実験を行えたらと考えています。
そのページにクローニング方法について説明があり、以下のように書かれてありました。
ttps://media.addgene.org/data/94/67/16242780-af64-11e0-90fe-003048dd6500.pdf

"Sense oligo: An HpaI site leaves a blunt end prior to the –1 position in the promoter. The sense oligo design must incorporate a 5’ T in order to reconstitute the –1 nucleotide of U6. An XhoI site cuts downstream of the U6 start site."

"Antisense oligo: Compliment of sense but with additional nucleotides at 5’ end to generate XhoI overhang."

とあり、
センス鎖は以下のようになる、と書かれてありました。
5’T-(GN18)-(TTCAAGAGA)-(81NC)-TTTTTTC 3’

これに関して２つ質問をさせてください。

１. shRNAの標的検索ツールで得られる候補shRNA配列は18塩基ではなく、21塩基で返ってきてしまう。この場合、上記プラスミドのNが21になってもいいのかどうか？また18に設定できるようなツールサイトはありますでしょうか？

2. アンチセンスの配列としては次の２つのうち、どちらが正しいでしょうか？
3’A-(CN18)-(AAGTTCTCT)-(81NG)-AAAAAAGGAGCT 5’　または
3’A-(CN18)-(AAGTTCTCT)-(81NG)-AAAAAAGAGCT 5’　か。

shRNAプラスミド構築は初めてで大変初歩的でかつ稚拙な文章になってしまい分かりづらくなっているかと思いますが、どうかご教示いただけますと幸いです。
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