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(無題) 削除/引用 No.11275-12 - 2023/03/17 (金) 17:09:04 - おお >[Re:8] OKさんは書きました : > 変異でタンパク質の量が減少するといのはまだ確認できていませんが、Foldingの可能性は否定はできません。 > > ただ過去の研究からは、KOするのとは全く表現型が異なるので、これまた解釈に悩んでいます。 要するにその変異体は注目している現象に対しては何の活性も持っていない。その変異体を導入するのも、全く関係のないgfpみたいなタンパク質を導入するのも細胞にとってあまり違いがないという事でしょう。

(無題) 削除/引用 No.11275-11 - 2023/03/17 (金) 14:43:56 - バベル 活発にレスのやりとりがなされていますが、議論がきちんと噛み合っていますか？傍から見ている者が茶々を入れてすみませんが、どうも話が行き違っているように見えるので確認させてください。 No.11275-4にある、「具体的には、タンパク質の発現です。」というのは、その強制発現しているタンパク質自体の発現なのですか？ 「 また、downregulateってどういう意味で使っていますか？私の理解では、ある機能分子のもつ機能を低下させる」というのが原義で、そこから転じて、受容体やシグナル伝達因子の量が減ることをそのように言うこともあるという表現ですが、その前提で話されていますか？

(無題) 削除/引用 No.11275-10 - 2023/03/17 (金) 13:12:23 - おお てか、発現の確認はしてないのですか？ならエンドが１０分子で５００の強制発現とかいう話も絵空事になりませんか？

(無題) 削除/引用 No.11275-9 - 2023/03/17 (金) 13:10:41 - おお 一応前のコメントでもかいたけど、 エンドの正常の発現量から強制発現させて分子を増やしたときに起こる現象を見るにはそのタンパクを発現してないコントロールがいるわけで、その現象について変異体でどう変わっているかを見るのであれば、やはり発現してないコントロールが必要です。 これがないと以下の事の区別が付きません。区別がつかないなら結局は次に発現させてないコントロールを取った実験をすることになります。 ネガティブコントロール：低 正常：高 変異体：低（ほぼコントロールと一緒か正常とコントロールのあいだ） の結果から活性の喪失 （もちろん完全に活性の喪失に決まりということでもありません） ネガティブコントロール：低 正常：高 変異体：コントロールより低い Downregulation （正常とは反対の活性をもつ、あるいは異なった活性を持つ） ネガティブコントロール：低 正常：低 変異体：コントロールより低い 正常に活性がないが変異体には何らかの活性がある。あるいは正常で上がるはずならこの実験系、あるいはこの実験は適切ではないとも言える。

(無題) 削除/引用 No.11275-8 - 2023/03/17 (金) 12:36:08 - OK 変異でタンパク質の量が減少するといのはまだ確認できていませんが、Foldingの可能性は否定はできません。 ただ過去の研究からは、KOするのとは全く表現型が異なるので、これまた解釈に悩んでいます。

(無題) 削除/引用 No.11275-7 - 2023/03/17 (金) 12:32:03 - OK 返信ありがとうございます。 タンパク質の安定性は分かりません。これから先の研究です。 ＞差がなくてもあると言い通すのですか？ ＞結論ありきでどうしてもその結論に持っていこうとしているような気がしますがそれは科学ではないですよ。 結論ありきでは全然ありません。最初の段階ですので、ここでこじつけてしまうと、後が続きませんので。単に、正常と異常を比較して、差があるという事実をのべただけです。重要なのは、ベクターのみを解釈に入れるとこの比較の解釈がどう変化するのか意見を募ったのみです。 ただ、上記のように言っていただくのは、貴重な意見です。 ほぼ同じ分子数であろうもの同士で比較をして、差があるので、変異と正常で違いがあるのではと解釈する方に自分はやや傾いています。つまり、変異にはupregulateする活性がない、downregulateする、機能が欠失している、あたりを仮説に考えています。

(無題) 削除/引用 No.11275-6 - 2023/03/17 (金) 12:03:45 - 　bh 情報がかぎられてるのでほとんど推測ですが、変異遺伝子のコードする蛋白質が不安定ですぐ分解されてしまうような場合はcontrol (内在性のみ）=変異型遺伝子を導入した細胞（事実上内在性のみ）＜正常型遺伝子導入した細胞(導入した正常型遺伝子のコードする蛋白質＋内在性)そのようなパタンになると思います。 １アミノ酸の置換でも折りたたみに失敗して機能蛋白質として完成する前に分解されてしまったり、構造が変わり不安定化して容易にプロテアーゼで分解されてしまう→当該蛋白質の量的減少による機能低下、ような機序はいくつかの疾患メカニズムなどでもありますね。 テクニカルな問題がないならば、こういうデータがほしいとか、こうなるはずなのだが、というのは、注意しないと、ときに目の前にあるものすごい重要な発見を逃すことがあるようにおもいます

(無題) 削除/引用 No.11275-5 - 2023/03/17 (金) 11:58:51 - おお >downregulateさせた、機能が欠損したという仮説も立てられると思うのですが、それは全否定されるものでしょうか。 downregulateと機能が欠損は別物でしょう。その実験だけではどちらとも言い難いです。 ＞ベクターと変異強制発現を比較するというのは、10の正常タンパク質と500の変異タンパク質を比較しているようなもので、 本質的にエンドの正常の発現と比較しようとしているデザインではないはずです。あなたのおっしゃるベースラインになるべくコントロールではではないですか？これがなかった場合正常の強制発現で活性が見られたのかどうかもわからない。もし正常で活性が見られず、変異で正常やネガティブコントロールより低いなら変異体にはDownregulationを起こす活性があると言えます。正常で活性が見られて、それより変異体が活性が低いがコントロールと変わらないかそれ以上であるならその実験から機能欠損か低下と考えて進めるのが普通だと思います。 それでもどうしても発現した量が気になるならGFPでも発現させて活性があるはずのないものを発現さてそれと比べるというやり方があります。

(無題) 削除/引用 No.11275-4 - 2023/03/17 (金) 11:19:19 - OK 具体的には、タンパク質の発現です。 ＞ネガティブコントロール：低 正常（変異なし）遺伝子：高 変異遺伝子：ネガティブコントロールより明らかに低い こうなれば理想的ですね。 おっしゃっている内容は十分に理解できます。しかし、 純粋に正常と変異の強制発現のみを比較する、つまり分子数が同じもの同士を比較したと考えれば、downregulateさせた、機能が欠損したという仮説も立てられると思うのですが、それは全否定されるものでしょうか。 ベクターと変異強制発現を比較するというのは、10の正常タンパク質と500の変異タンパク質を比較しているようなもので、数値も一致していなければ、タンパク質のタイプも異なるので比較ができないと思います。変な例えですが、50mlの塩水と1Lの砂糖水どちらなら飲めますか？という質問と同じです。50mlの塩水と50mlの砂糖水の比較や1L同志の比較なら分かりますが。

(無題) 削除/引用 No.11275-3 - 2023/03/17 (金) 10:59:27 - asan 例えばドミナントネガティブのキナーゼや基質変異体とか入れたらそうなるのでは？

(無題) 削除/引用 No.11275-2 - 2023/03/17 (金) 10:25:11 - おお >コントロール、正常遺伝子強制発現、変異強制発現を比較すると低、高、低となります。これは、差ありと解釈していいのでしょうか。 何が低、高、低なんでしょうか、、、何らかのフェノタイプ？ ＞ベースラインとは差がないんですよね。 ベースラインって具体的に何をベースラインにしているんですか？何らかのアッセイでブランクをベースラインとしているとか、何も強制発現させてないものとか、、、 変異させたものはあなたが見ている活性をUpregulationする活性は見られなかったというのが結論ではないですか？ ＞あるいは極めて小さいけれどもあると解釈してもいいのでしょうか。 差がなくてもあると言い通すのですか？その実験だけにおいてそれは無理です。ただしあなたのアッセイで差が見れてないだけの可能性はあります（それでも見えてないものを見えるというのは変ですよ）。他の実験や現象などから完全に活性がなくなったとまでは言い切れないと思えるなら、そういう結果を全体から完全に喪失したわけではないだろうという考察をするといいです。 ＞そうなると生理学的意義はないと解釈される 意味がわからないです。変異により活性が損なわれるなら、その変異が病気由来のものであれば機能的な喪失が病気の原因になっている可能性もあるだろうし、変異の位置が人工的なものであれば、変異を導入した位置はその活性に重要な役割を持っていると言えるだろうし。そもそも結論ありきでどうしてもその結論に持っていこうとしているような気がしますがそれは科学ではないですよ。 ちなみに、 ネガティブコントロール：低 正常（変異なし）遺伝子：高 変異遺伝子：ネガティブコントロールより明らかに低い なんていう結果がでるような遺伝子を知っています。

強制発現の解釈 削除/引用 No.11275-1 - 2023/03/17 (金) 09:50:48 - OK ある遺伝子異常の解析を行っているのですが、正常の遺伝子と変異のある遺伝子を強制発現させた時の解釈に苦労しています。 コントロールとして強制発現なしも入れているのですが、コントロール、正常遺伝子強制発現、変異強制発現を比較すると低、高、低となります。これは、差ありと解釈していいのでしょうか。 ベースラインとは差がないんですよね。そうなると生理学的意義はないと解釈されるのでしょうか。あるいは極めて小さいけれどもあると解釈してもいいのでしょうか。 そもそも、コントロールは論文から除外してもいいのでしょうか。

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