BioTechnicalフォーラム [FLAG peptideを使用した溶出について]

FLAG peptideを使用した溶出について

No.11274-TOPIC - 2023/03/16 (木) 23:06:19 - たこ助

平素よりお世話になっております。
現在1xFLAG-tagged proteinの精製について実験のセットアップを行っております。
非常に初歩的なことなのですが、1xFLAG-tagged proteinを3xFLAG peptideで溶出することに何か利点はあるでしょうか？
一般に溶出効率が上がるというのであれば使用しても良いかとは思いますが・・・
酸溶出やGly-HCLでの溶出は活性の点から除外しております。

ご教示賜れますと幸甚です。
　

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No.11274-12 - 2023/04/03 (月) 01:23:44 - たこ助

諸先生方

ありがとうございます。
その後小スケールで試してみたのですが、1x peptideでも3x peptideでも私の実験では溶出効率はあまり変わらないという結果になりました。
厳密な定量的評価はしておりませんが、自分の中で結論は出せました。
1x peptideの納入が非常に遅いため3xを使用する必要があり、利点があるならば3xにしようと思っていましたが、特に私の実験で3xを利用するメリットはないようでした。

ご多忙の中ありがとうございました。
今後また質問をすることがあると思いますが、よろしくお願いいたします。

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No.11274-11 - 2023/03/18 (土) 09:17:48 - 2ME

M2抗体に対するエピトープ配列はDYKDDDDKとされているので、分子間距離と配列が異なるDYKDHD配列はM2抗体と結合するのだろうか、結合するとしてもかなり弱いのではないか、と思ったまでです。であるならアフィニティではなくアビディティで説明するのが妥当だろう、という程度の話をしたまでです。データに基づかず、頭でこねくり回した話をしているだけですので、ご勘弁ください。

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No.11274-10 - 2023/03/17 (金) 17:01:37 - おお

>[Re:8] 2MEさんは書きました :
> 書き間違えました。
> 正しくは
> M2抗体のDYKDHD(G/I)に対するaffinityはDYKDDDDKに対するそれよりもおそらく劣っているのだろうが、3xFLAGはDYKDHD(G/I)x2の分だけavidityに優れている。
> 失礼しました。

3xmyc はアミノ酸レベルで同じ配列の繰り返しですけど(私がみたことあるのは)、3つ並べる事でアフィニティーが一桁以上ちがう(単なる三倍とかではない)ので、別に配列の違いによるアフィニティーの違いを持ち出さなくても説明がつくと思うのだが、

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No.11274-9 - 2023/03/17 (金) 10:57:23 - asan

1xで溶出できるなら1xのほうがいい場合もあります。質量分析などで3xだとペプチド鎖が長いのでSDSpageで引きずる場合があります。

3x peptideは3xFLAG IPの時に1XFLAGだと回収効率が低いので使用するものという認識でいいと思います。

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No.11274-8 - 2023/03/17 (金) 10:00:29 - 2ME

書き間違えました。
正しくは
M2抗体のDYKDHD(G/I)に対するaffinityはDYKDDDDKに対するそれよりもおそらく劣っているのだろうが、3xFLAGはDYKDHD(G/I)x2の分だけavidityに優れている。
失礼しました。

(無題)

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No.11274-7 - 2023/03/17 (金) 09:48:19 - 2ME

誤情報を書いてしまいました。申し訳ありません。

1xFLAGタンパクに3xFLAGペプチドは行けそうですね。

1xFLAG：DYKDDDDK
3xFLAG：DYKDHDGDYKDHDIDYKDDDDK

M2抗体のDYKDHD(G/I)に対するaffinityはDYKDDDDKに対するそれよりもおそらく優れているのだろうが、3xFLAGはDYKDHD(G/I)x2の分だけavidityに優れている。
理屈ではこれでしょうね。
ご容赦。

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No.11274-6 - 2023/03/17 (金) 08:09:51 - おお

>1xFLAGタグタンパクの溶出にも3xFLAGペプチドは使えないのでは。

使っている論文は見かけますけどね。
配列がシンプルなリピートではないですが、それよりもアフィニティーの強さの問題だと思います。より結合力の強い３XFLAGであれば１XFLAGはキックアウトされるような形になるので理論上は効率が良くなるか、加えるペプチドの量を減らせるか（FLAG M2抗体の場合でほかはアフィニティーがどれくらい変わるか記述を見てないのではっきりとしたことは言い難いが多分ほぼ同様）。

３xFLAGタグに１xFLAGペプチドを使ったときにはアフィニティーが３xFLAGより弱いので溶出がしにくくなる。

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No.11274-5 - 2023/03/17 (金) 08:08:48 - フラグ

え？使えないんですか？
ペプチド配列が違ってても同じ抗体にエピトープとして認識されるのであれば、抗体への結合は競合するでしょう。3xの方がavidityが高い分、効率よく溶出できると思っていたのですが違いますか？

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No.11274-4 - 2023/03/17 (金) 07:34:08 - 2ME

>[Re:1] たこ助さんは書きました :
> 現在1xFLAG-tagged proteinの精製について実験のセットアップを行っております。
> 非常に初歩的なことなのですが、1xFLAG-tagged proteinを3xFLAG peptideで溶出することに何か利点はあるでしょうか？

利点はないと思いますよ。

1xFLAGタグタンパクの溶出には1xFLAGペプチドを、3xFLAGタグタンパクの溶出には3xFLAGペプチドを使うと言われている。

ご存じだと思いますが、3xFLAG配列は1xFLAG配列の単純な3回繰り返しではない。

3xFLAGタグタンパクの溶出に1xFLAGペプチドは使えないと言われている。
https://www.ptglab.co.jp/news/blog/flag-tag-and-3x-flag-tag/

おそらく1xFLAGタグタンパクの溶出にも3xFLAGペプチドは使えないのでは。
使えないとは効率低下か非特異増か。たぶん両方か。
いずれにせよ、私はそういうクロスした使い方をした経験がないので、受け売りを述べたまでです。ご容赦。

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No.11274-3 - 2023/03/17 (金) 02:28:00 - たこ助

ご説明が足りず大変失礼いたしました。
1xFLAG peptideで溶出する場合と3xFLAG peptideで溶出する場合で、溶出効率に差があるのかという点をお伺いしたかった次第です。

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No.11274-2 - 2023/03/17 (金) 00:33:17 - おお

メリットとしては、生理的な条件に近い非変性条件で溶出できるという事です。他の条件は大抵生理的な条件から大きく逸脱していると思います。と言うかどう言う条件を考えているのでしょうか。

FLAG peptideを使用した溶出について

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No.11274-1 - 2023/03/16 (木) 23:06:19 - たこ助

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