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(無題) 削除/引用 No.11269-8 - 2023/03/15 (水) 11:40:23 - G25 この件に限らず、空のレーンを挟むとき、あるいはゲルの両端レーンには、まるっきり空っぽにしておくんじゃなくて、素のサンプルバッファーをロードしておくというのがよく知られているtipsですね。 空のレーンと隣り合ったレーンでスマイリングしたりラッパ状に広がるなどパターンが乱れるのを防ぐためです。 空のレーンに素のバッファーを乗せておくと良かったかもしれません。 サンプルに夾雑物が多いとかpHをTrisを加えて調整するなど、組成がかなり違っているかもしれないので、それでもまだ乱れたかもしれませんが。

(無題) 削除/引用 No.11269-7 - 2023/03/14 (火) 17:44:09 - dsds アドバイスをいただきありがとうございました。 サンプルは、特定のタンパク質を抽出・精製している過程の溶液で、塩濃度・酢酸濃度ともに高い状態です。 再度SDS-PAGEを行ったところ、泳動先端に向かって細くなる現象は無くなりました。 前回と違う点は、サンプルの間に空のレーンを作らず、マーカーまたはサンプルを隙間なく並べた点、サンプルへのTris添加量を増やした点です (前回はpHが若干酸性寄りでした)。 ただ、先輩とサンプルの調製法は同じだったので、Trisの量は関係なさそうです。 空のレーンの有無が関係していそうですが、その場合、むしろ広がりそうなものですが、逆に細くなっていました。 Urea入りのゲルでは、サンプルのアプライ前にウェル内の洗浄をいつもより念入りに行う (Ureaが溜まっているため) のですが、先輩に比べて洗浄操作が甘かった可能性があります。これは影響しますでしょうか？ 泳動先端に向かって細くなる現象は無くなって良かったものの、原因は分からないままです。

(無題) 削除/引用 No.11269-6 - 2023/03/14 (火) 11:16:02 - 　bh sample組成に原因があると思われます。１）塩濃度が極端に高い（ただこの場合はむしろレーンの幅が横にひろがることがおおい）、２）リポ蛋白質を多量に含むなどの原因で脂質が非常に多い、３）特定の量の多い蛋白質がある（比較的多い量の血清sampleを泳動したとき、アルブミン（66KDa)よりも下がレーンの横幅が細くなることを以前に経験しています。４）非イオン性界面活性剤を多量に含む（SDSの作用を妨害することがあります）。5) 植物などのサンプルで糖など非タンパク質性成分による、などが考えられます。 sampleの夾雑物や塩が影響していることが懸念されるならば、TCA沈殿→冷アセトン沈殿、もしくは脱塩カラムなどで前処理して除去してから行うか、lysis bufferの量を減らしてsampleの蛋白質濃度を高くしてSDS-bufferとの混合比を変えるとかで対処できます。TCAは残存すると泳動パタンが変になったりみだれることあります。 私たちは直接、細胞を適量（量が多すぎると蛋白質濃度が低くなり後で困るので注意）のSDS-buffer (還元剤なし、BPBなし）で溶解→DNAを切断→BCA法で蛋白質濃度定量→還元剤添加して、加熱→泳動でやってます。 pHについては酸性サンプルに少量のThisを加えて青くしてから泳動することは時々しますが、このようなトラブルは起きていません。 ただ通常のlysis bufferは中性~弱アルカリとおもいますが、試料のpHが低くなることの原因としておもいあたること何かありますか？ レーンのことはこの問題とは直接にはかんけいないとおもいますが、もしレーン間をあけるならば、空いてるレーンにはsannple bufferを等量アプライしてください。何も流さないと、サンプルの蛋白質が泳動中に横に拡散してレーン幅が太くなります。

(無題) 削除/引用 No.11269-5 - 2023/03/14 (火) 09:08:51 - dsds コメントいただきありがとうございます。 ・マーカーのレーンでは細くなる現象は見られませんでした。 ・今回、Urea入りで初めて泳動しました。同じサンプルを、同じ操作で、先輩と一緒に 泳動したのですが、自分の方だけ細くなる現象が見られました。 先輩との違いは、2サンプルを並べて泳動したか、1レーン開けて泳動したかです (前者が先輩)。 ・サンプルはもともと塩や夾雑物が多い動物組織由来の抽出液です。sample bufferと1：1で混合した時に、青色にならない (酸性) ので、Trisも少し添加して、pHを調節しました。 アドバイスいただけましたら幸いです。

(無題) 削除/引用 No.11269-4 - 2023/03/13 (月) 18:06:13 - おお 塩やDNA含む共雑物の影響でレーンが変になる事は良くあります。一番簡単な回避方法は少ない量流す事です。1／3ぐらいに減らせませんか？

(無題) 削除/引用 No.11269-3 - 2023/03/13 (月) 18:00:31 - G25 夾雑しているDNAが邪魔をしているときの典型例 https://www.thermofisher.com/jp/ja/home/life-science/protein-biology/protein-biology-learning-center/protein-gel-electrophoresis-information/western-blot-troubleshooting.html そのほかにも、豊富にあるタンパク質がぶっといバンドを作っていると、それより先のバンドが縮こまる傾向がありますけど。 ロード量を減らしてみる？ いつもは起こらない現象とのことですが、今回の実験でなにか違っているところはありますか。

(無題) 削除/引用 No.11269-2 - 2023/03/13 (月) 16:49:46 - 　bh マーカーのレーンも同様のパタンをしめしますか？それともサンプルのレーンだけですか。

SDS-PAGEのバンドが泳動先端に向かって細くなる現象 削除/引用 No.11269-1 - 2023/03/13 (月) 16:10:24 - dsds SDS-PAGEのゲル (Urea入り・5%) を作って、還元・熱変性済みのサンプルを流し、CBB染色をしたところ、泳動先端に向かってバンド (レーン全体) が細くなっていました。 アプライした場所から下に行くほどバンド幅が細くなっていて、イメージとしては、P1000のチップのような形状で、目的バンドとスメアが見られる状態です。 これまで、あまりこういった現象はなかったのですが、泳動先端に向かって細くなってしまった原因は何でしょうか？

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