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(無題) 削除/引用 No.11265-15 - 2023/03/18 (土) 00:01:31 - おお 他トピで議論がありますが、溶出をFLAGペプチドで行うと、ビーズへの非特異吸着したタンパクは理論上溶出されません。

(無題) 削除/引用 No.11265-14 - 2023/03/17 (金) 17:19:31 - おお >[Re:10] dynabeadsさんは書きました : > たくさんの返信ありがとうございます。 > > dynabeads co-immunoprecipitation kitの通りに、免疫沈降しています。 > > 3. 10万Gの遠心は一般的ですか？核内因子が多く吸着していることからも、核成分が残存して、遠心で取り除けなかったのですかね。 一般的とまで言いませんがとくしゅとまでもいいません。10万gだせる遠心機がないらぼもあるでしょうし、ただ高速遠心機を持っているなら3万gとか使うと言う事もあります。ただ、万能というわけでもありません。フィルター使うというのもあるにはありますね。 > > > つまり、必要なものも一緒に根こそぎなくなるか、非特異的なバンドががっつり残るかの、せめぎあいで、結局解釈の難解さが変わるだけで、都合のいい領域ってなかなかない気もしています。もちろん、 > > 5. preclearはもちろんした方がいいのでしょうが、dynabeadsの使い捨て、結構はずみますね。 まあ、結局のところバックグラウンド(ノンスペ)は多かれ少なかれ出るわけだから、解析する時にバックグラントをなんらかのやり方で差し引くことにはなりますね。

(無題) 削除/引用 No.11265-13 - 2023/03/17 (金) 13:52:42 - 散々 M270 epoxy beads は免沈の初心者でも抗体結合したイムノビーズの作成が容易なように、縮合剤不要で調整を楽にしたことを謳った製品だが、　性能は度外視して提供されている製品なので、それで性能を議論するのはそもそもナンセンス。 epoxy beadsは、通常、抗体のアミノ基とカップリングさせるが、チオール基と反応させる場合と比べると反応性は低いので抗体が結合しにくい。 せっかくDynabeadsを使うなら、表面活性化ビーズの中からDynabeads™ M-270 Carboxylic Acidとかを選ぶべきだろう。 同様な製品は日本のメーカーでも売ってるので、イムノビーズの調製がネックなら、日本語の取説がついてるこっちを選べば良い。 医学生物学研究所（MBL）のMagnosphere beads. https://ruo.mbl.co.jp/bio/dtl/P/?pcd=J-MS-S300C それでもなおイムノビーズの調製が心配なら、混ぜるだけで調製できるProtein A/Gの製品を選ぶ手もあり、DynabeadsならProtein G for Immunoprecipitationという粒子がある。 この掲示板でも話題があったが、Bio-RadでもProtein A/Gの磁性粒子の扱いがあり、比較的安かったのだが、終売となってしまったようなのは残念。

(無題) 削除/引用 No.11265-12 - 2023/03/16 (木) 15:02:21 - toto M270 epoxy beadsに抗体は十分量結合されてることは確認されてます？epoxy beadsは、糖鎖を介した結合だったと思いますが、そのカップリング効率はあんまり高くなかった記憶があるので。それで私らはNHS-Activated Magnetic Beadsを使ってアミノ基で抗体を結合させて、preclearなしにIPで免沈させたものを直接、質量分析にかけるというのはよくやってます。ＭＳでは抗体なしのものとの比較で結合物を調べるので、電気泳動して共沈物をみるのにパターンが汚いとかいう問題はあんまりシビアにはなりません。確かにその方法でやってたときはpreclearは結構必須でした。

(無題) 削除/引用 No.11265-11 - 2023/03/16 (木) 12:51:33 - mp 会合蛋白の網羅的同定を試みていらっしゃるのですよね。 もう、ある程度ノンスペ蛋白はくっつくのはしょうがないという前提で、例えば免疫沈降物を丸ごとDIAプロテオームで定量的に比較解析して、コントロールを引き算すれば特異的な蛋白を同定できるんではないですかね（やったことないけど）？

(無題) 削除/引用 No.11265-10 - 2023/03/16 (木) 12:22:47 - dynabeads たくさんの返信ありがとうございます。 dynabeads co-immunoprecipitation kitの通りに、免疫沈降しています。 1. FlagはFG4Rを使っているのですが、これが問題でしたかね。。。結構いろいろな用途に使われている抗体だと思ったのですが。M2にしておくべきでしたかね。 2. M270 epoxyというビーズです。共有結合させています、抗体を 3. 10万Gの遠心は一般的ですか？核内因子が多く吸着していることからも、核成分が残存して、遠心で取り除けなかったのですかね。 4. 自分の経験上ですが、bufferのstringencyを変えるのは、single bandを検出するような実験であるならば、有効なのですが、binding affinityのprofileを網羅的に検出するケースでは本当に難しいと思っています。 つまり、必要なものも一緒に根こそぎなくなるか、非特異的なバンドががっつり残るかの、せめぎあいで、結局解釈の難解さが変わるだけで、都合のいい領域ってなかなかない気もしています。もちろん、 5. preclearはもちろんした方がいいのでしょうが、dynabeadsの使い捨て、結構はずみますね。

(無題) 削除/引用 No.11265-9 - 2023/03/14 (火) 23:59:29 - おお あと言及してないのはpHかなぁ

(無題) 削除/引用 No.11265-8 - 2023/03/14 (火) 23:56:45 - おお >[Re:6] 1さんは書きました : > 最後の溶出の前に0.5MくらいのNaClを含むbufferでビーズを１回洗って、そのあと溶出を行ってみることを試してみてください。 CHIPではNaClのかわりにLiClで３００mMで洗うプロトコールが出回ってますね。Naイオンはイオン結合を緩めるのがメインですが、Liイオンはカオトロピックな作用があるのでイオン結合を緩める以上の作用が期待されます。濃度が低いのはイオン強度の違いがあるのも理由の一つです。Naイオンよりイオン強度が強いものとしてKイオンもあります。この場合４００mM弱が５００mM Naイオンと同等です。ただKイオンはSDSと相性が悪いので使いにくいのは確かです。 いずれにしろ特異的なイオン結合などの緩めるので興味があるタンパクの相互作用に適しているかどうかは気をつけて置いたほうがいいでしょう。

(無題) 削除/引用 No.11265-7 - 2023/03/14 (火) 23:01:11 - 散々 Dynabeadsを使っていると言うが、どのビーズ（M270なのかM280なのか？）なのか、抗体はどうやって結合してるのかが分からなければ、不具合の原因は分からないよ。 抗体もFlagといえば純正品のクローンM2が基本だが、どれですか？

(無題) 削除/引用 No.11265-6 - 2023/03/14 (火) 19:28:29 - 1 磁性ビーズを使用されているとのことなので、たとえば、最後の溶出の前に0.5MくらいのNaClを含むbufferでビーズを１回洗って、そのあと溶出を行ってみることを試してみてください。非特異的に吸着した蛋白質を減らすことでは、この方法が今まででは一番よかったです。 もちろんPrecleanもある程度有効なこともありますし、界面活性剤の条件も検討の余地はありますが、経験ではいずれも期待するほどには改善しない（多少はマシかなあくらい）ことが多い印象があります。もし対象が核蛋白質ということならばDNAはどのように処理されているでしょうか。

(無題) 削除/引用 No.11265-5 - 2023/03/12 (日) 05:26:58 - おお >タグのみの沈降 はタグのみのカラベクターのtransfection をしたネガティブコントロールでしょう。 まあ何をしてもあぐりやすいタンパクはあるもので、そういうのがビーズに絡まるみたいなことはあります。プレクリアをやること、非特異な相互作用を低減するためにストリンジェンシーを上げる事などです。 後者はデタージェントのをいじるとか塩濃度を上げるとか、カオトロピックなケミカルを使うとか。デタージェントはTRITON X 100 (1％ぐらいまで)、それより少し強そう(あるいは効き方が違う)のデオキシコール酸。コール酸、CHAPS。これらはTRITONとコンビネーションで使うことがある。デタージェントを混ぜると弱くなるとも言われるが、作用特性も広がる。一番ストリンジェンシーが高いのが、SDSが入ったRIPAバッファー。このバッファーはノンスペがほとんどない。ただし、目的のタンパク質との相互作用や抗体と目的のタンパクとの相互作用にたいしてもストリンジェンシーが高いので万能とは言えない。抗体がこの条件でワークするならdspなどのクロスリンカー処理をあらかじめしておくのもありでしょう。カオトロピックな試薬でLi+、Mg++、ClO(4) -、SCN- などで他にもあるがそれらは変性作用が強すぎるので使いにくい。LiイオンはたまにIPのノンスペを低減するのに使われる。 プレクリアは2通りあって、遠心が一つやれること。特に10万g以上の超遠心でmicrosome などの膜断片や微粒子が除ける。もう一つは、同等の素材のビーズでノンスペがを吸収することだが、磁気ビーズを使うにしても、セファデックスやアガロースビーズでプレクリアしても非特異吸着は低減できるでしょう。 もう一つ思い出したのはビーズのブロッキング。BSAやPVPに一時間からO/Nで晒しておくという場合。 RNA関連のタンパク質が多いということなのでRNase処理も改善に寄与するかもしれない。あるいはそういうタンパがあまり混入しないようなフラクショネーションをするか。 IPフラクションのMS解析を考えているならTandem affinity purification (TAP)も視野にはいるかな。

(無題) 削除/引用 No.11265-4 - 2023/03/11 (土) 19:57:36 - veg Flag-tag蛋白質を抗Flag抗体で免疫沈降する実験において``タグのみの沈降``っていうのがよくわかりません。

(無題) 削除/引用 No.11265-3 - 2023/03/11 (土) 14:20:52 - G25 サプライヤーの言うことにゃ、 https://www.thermofisher.com/jp/ja/home/life-science/protein-biology/protein-assays-analysis/immunoprecipitation/immunoprecipitation-faqs-dynabeads-magnetic-beads.html#5 わたしならそういう時、まずpreclearを勧めるけど。 サプライヤーはDynabeadsはpreclearが必要ないほど切れ味が良いと言ってるけど、鵜呑みにはできない。

(無題) 削除/引用 No.11265-2 - 2023/03/11 (土) 13:00:38 - み Buffer組成や濃度、細胞・組織種類、洗浄方法などが重要だと思いますが開示できませんか？

免疫沈降で苦戦しています。 削除/引用 No.11265-1 - 2023/03/11 (土) 10:51:17 - dynabeads dynabeadsとFlag抗体の組み合わせで免疫沈降をしたのですが、タグのみの沈降で、核内リボプロテイン関係やスプライシングファクターががっつりくっついてきます。 どなたかご経験のある方いませんか。

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