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(無題) 削除/引用 No.11254-6 - 2023/03/08 (水) 12:03:25 - Aom おお様 ありがとうございます。 ラベリング効率を見た時、同じような光度を出すスポットの濃度は、効率が悪いDNAと良いDNAで10倍くらい差ありました。なので差があり過ぎなのですかね… ラベリングを2回やるのは思いつきませんでした！検討してみます。 とりあえず、薄いバンドだけ濃度あげて一度ゲルシフトしてみます。 その後、ラベリング重ね付けや試薬の変更なども考えてみようと思います。 みなさまありがとうございました。

(無題) 削除/引用 No.11254-5 - 2023/03/08 (水) 04:52:53 - おお 私はラベルの効率を一定以上にして（例えば５０％以上とか）、DNA量を揃えるべきかと思います。そうすることで微妙な結合力のの変化は定量が難しいですが、３倍以上差がついているならバンドの強さで判断できます。なぜならばラベルの効率が最低で５０、最高で１００％とすると効率によるブレは２倍。実際はそんなに極端な事はないと思うので。 フリーと結合しているものの比を取ればいいような話もあるけど、フリーが殆どを占めるためシフトしたバンドを見るにはフリーのシグナルはすでに飽和していることが大抵なので。まあ反応液の１０％をTBE PAGE（１０％とか？）などで流してインプットのStandardizeに使うならできない話でもないけど。 使ったことはないけどterminal deoxynucleotidyl transferaseでラベルするのなら一度ラベルして効率が悪かったものは、そのラベルしたものに更にラベルを入れれると思う（理屈上は）。

(無題) 削除/引用 No.11254-4 - 2023/03/08 (水) 00:02:56 - Aom G25様 ありがとうございます。 1．は強度を合わせる（薄いバンドだけ高濃度にする） 2．は濃度を合わせる（薄いバンドが見える高濃度に合わせてすべての濃度を上げる） という意味で書いていたので逆かもしれないです・・・ ”シフトするしないを1/0で見る”のがまず優先事項なのでまずはすべてのバンドを見えるようにするのを目指そうと思います。 ＞シフトしたフラクションとしなかったフラクションの強度の比で評価すれば良い これはDNAとタンパクを流したレーンで複合体のバンドと残りのFree DNAのバンドを比較するということでよいでしょうか。それとも別レーンにコントロールとしてDNAのみを流したバンドと比較することですか？ ばん様 ありがとうございます。 DNAはできれば少ないほうが良いのですね。

(無題) 削除/引用 No.11254-3 - 2023/03/07 (火) 21:06:34 - ばん EMSAですね。基本はDNA濃度<<KD（解離定数）であれば、結果はDNA濃度に依存しません。 要するに検出可能な最低濃度を使うべきです。 単に定性的な結合の有無を調べたいのであれば、それほど気にする必要もありませんが、できるだけ低濃度でというのが基本です。

(無題) 削除/引用 No.11254-2 - 2023/03/07 (火) 19:17:56 - G25 シフトするしないを1/0で見るなら、プローブ毎にラベル効率やmol数がばらついても構わないとおもいますが、定量的にシフトの程度を評価するなら比較するならそこんとこ揃えないときれいなデータになりませんね。 1はおそらくmol数を合わせるが結果としてプローブ毎に強度が異なるということで、 2は強度をそろえるとプローブのmol数が異なるということでしょうか。 どっちかというと1のほうが好もしいと思います。 プローブ毎に強度が違うとしても、１つのプローブのなかで、シフトしたフラクションとしなかったフラクションの強度の比で評価すれば良いんじゃないかと思います。 2は、ラベル効率の悪いプローブでは量を多く投入するということになりますよね。未標識と競合してシグナルが弱まるだけでなく、後々、非標識プローブと競合させて特異性を証明しようとなったとき、競合の効果が見えにくくなったりしないかしら。 お金に余裕があるならプライマー合成の段階で5'末端標識しておく。 DIGだと高いからこの際、biotinの系にしてしまう（ユーロフ◯ンで見たら、それぞれ2万円と8千円）。標識効率はかなり高いはずだし、PAGEかHPLCの精製したらほぼ100%だろう。

ゲルシフトアッセイのDNA量について 削除/引用 No.11254-1 - 2023/03/07 (火) 18:31:42 - Aom 複数のDNA断片のどれが転写調節因子と結合するかを調べるゲルシフトアッセイを行っております。 PCRからのゲル抽出によって精製したDNA断片を3‘DIGラベリングしたものを用いております。一度ラベリング効率をしてみて、使えそうな濃度に各DNA断片の濃度を希釈しました（すべて同じ濃度に揃えています）。しかし、ゲルシフトを行ってみると各DNAで発光がかなり異なり、はっきりバンドが見えるものからうっすらとしか見えないものがありました。再度行ってもあまり変わりませんでした。 この場合、 　1．それぞれのDNA断片に適した濃度に合わせる。 　2．最も薄いバンドがはっきり確認できるようになるまですべてのDNA濃度を一律に濃くする。 　3．もう一度ラベリングからやり直す。 の方法を考えたのですが如何でしょうか。アドバイスをください。 1の場合、DNA量が異なるとき、DNA-タンパク質の結合の様子の違いが判るのか。 2の場合、DNAが多すぎることで何か不都合があるのか。 がわからないです。

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