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(無題) 削除/引用 No.11253-6 - 2023/03/07 (火) 15:58:24 - G25 特異性が高いというのは、正しいPCR産物にのみハイブリダイズするTaqMan probeで検出するから非特異的産物があってもシグナル強度に干渉しにくいというだけで、非特異的増幅が起こらないということではないですね。 非特異的産物の増幅が起こっているということは、少なからず特異的産物の増幅に干渉していると思いますが。 非特異的産物というのは実はゲノムDNA由来ということはないですよね。 でもスプライシングバリアントという可能性は？ SYBR Green系ででた非特異的産物とTaqMan系で(両者のプライマーセットは同じではないわけですよね）でた非特異的産物とは実は由来がおなじスプライスバリアントで、原理的に増幅しておかしくないものだったりして。 ELISAとの食い違いはまた別の話。 極端な話、転写後調節やタンパク質分解の調節などで、転写産物量とタンパク質量がパラレルでない場合もありましょう。

(無題) 削除/引用 No.11253-5 - 2023/03/07 (火) 13:36:05 - T-2 スプライシングバリアントの可能性はないかなぁ。 例えばExon1-Exon2-Exon3の遺伝子でプライマーがExon1, Exon3に当り、 プローブがExon1にある場合、Exon1-2-3のバリアントとExon1-3のバリアントは 共に増幅され、シグナルが見られるがアンプリコンの大きさが異なる。

(無題) 削除/引用 No.11253-4 - 2023/03/07 (火) 13:33:48 - おお タンパク質が検出されないから、mRNAが検出されないだろうと考えているなら、それは思い込みに過ぎないわけですが、mRNA量に差がとりあえずは、タンパク発現の説明にはなるはずです。

(無題) 削除/引用 No.11253-3 - 2023/03/07 (火) 11:44:44 - 774 正しいサイズのものは、タンパクが検出限界以下であっても転写がないとは限らないと思いますし、コンタミの可能性もありませんかね？ 非特異的なものはなんでしょうねぇ。気になるならシークエンスを読むのもありかもしれません。

(無題) 削除/引用 No.11253-2 - 2023/03/07 (火) 06:03:13 - おお TaqMan probeだから非特異的増幅が起きないというのはちょっと違って、非特異的増幅が起きるかどうかはプライマーの問題です。ただし、TaqMan probeは増幅されたアンプリコンの内部の配列にハイブリするので、非特異的に増幅した配列にハイブリする部分がなければ特異性を維持できます。それが特異性が高いという謳い文句の理由です。 気になるならプローブよりもプライマーを変えるのがいいとは思いますがプラクティカルに無視していいか、どのように特異性を確認するべきかは経験が豊富な人のコメントを待ちましょう。メーカーによっては独自に設計した配列で特異性を保証しているものもあるようですがどこまで信用していいかも判断に悩むところでもあります。

TaqMan qPCRでの非特異的増幅産物 削除/引用 No.11253-1 - 2023/03/07 (火) 04:15:22 - TaqMan 　論文のプライマーセットを用いて、SYBR Green系で検体中のある遺伝子の発現解析をqPCRにて測定を試みたところ、非特異的な配列が増幅されてしまいました（解離曲線のピークがスタンダードは異なっていたため）。アニーリング温度やPCRのプログラムを変更してみましたが、非特異的な配列の増幅が認められたので、このプライマーセットによる検体中の遺伝子の発現解析は不適と判断しました。 　特異性を更に高めるために、同じ遺伝子についてTaqMan probeによる検出が別論文で報告されておりましたので、その論文で報告されているプライマー、プローブを用いて再度遺伝子発現解析を試みています。目的の遺伝子産物であるタンパク質をELISAで検出した結果を基に、タンパク質が検出された検体、検出されなかった検体を並べてTaqMan qPCRを実施しました。その結果、ELISAでタンパク質が検出されなかった検体においてもスタンダードと同様の増幅曲線が認められました。不思議に思い、増幅産物をアガロースゲル電気泳動で確認したところ、スタンダードを同じサイズのバンドに加えて、更に別のサイズのバンドも認められました。 　TaqMan probe系によるqPCRはあまり経験がないので、皆さんにお聞きしたいのですが、一般的にSYBR Greenよりも特異性が高いと言われているTaqMan probe系によるqPCRでも非特異的な配列の増幅が認められるのはよくあることなのでしょうか？上記のような結果の場合、解釈に非常に困るのですが、どのように解釈するべきなのでしょうか？特異性が高いと言われているTaqMan probe系ですが、上記のような結果では、バンドサイズはスタンダードと同じでも配列が異なっている同サイズの非特異的配列が増幅されてしまっていると解釈するべきではないかと考えますが、SYBR Green系であればあり得ると理解できるのですがTaqMan probe系でも類似したことが起きるものなのでしょうか？TaqMan probe系ではSYBR Greenのような非特異的な配列の増幅は起きないはず、という先入観は取り払うべきでしょうが、特異性が高いですし、論文にも報告されているので、ちょっとどうなっているのだろうか？と少し困っております。皆さんのお知恵を拝借できれば幸いです。よろしくお願い申し上げます。

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