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(無題) 削除/引用 No.11250-12 - 2023/03/13 (月) 04:49:52 - たこ助 私は同じような経験をPrime Star Maxで経験しました。 数クローン取って全部同じエラー、でもtemplateのsequenceは問題ないという。 結局prime Star Maxでそのmutationを直してことなきを得ましたが。 私がよくいじくるものはKOD oneの方が走りやすいので第一選択はKOD One、代打Prime Star Maxとしています。 KOD Oneではいまのところ問題なく走っております。

(無題) 削除/引用 No.11250-11 - 2023/03/07 (火) 12:57:54 - AA 割引キャンペーンでまとめ買いすることが多いのでtakara品をよく使っています。 PrimestarシリーズやTksGflexなど普段は非常に満足して使っています。 ただ、ゲノムからクローニングするときに10クローン拾って全て別々の変異が入っていた、など何故かPCR産物がヘテロな集団になってしまう配列という経験はあります。 プラスミドからのmutagenesisで修正したときは大丈夫だったのでもしかするとPCRエラーではなくてsomatic mutationが入りやすい遺伝子だったのかもしれません。

(無題) 削除/引用 No.11250-10 - 2023/03/07 (火) 11:17:28 - 2ME 個人的印象ですが、 high-fildelity酵素としてKOD One、Ex Premier、PrimeSTAR Maxを使っていますが、fidelityに関してはPrimeSTAR Maxが上で、KOD OneとEx Premierが同等な感じです。1kbp〜10kbpに1塩基変異が入るかどうかという感じです。いずれも普段の使用には問題を感じていません。

(無題) 削除/引用 No.11250-9 - 2023/03/07 (火) 10:06:57 - 567 ちょっとさんのコメントは強烈な不快感を感じる。 匿名だからといって発言には気をつけなよ。よくそんなことを書けるな。

(無題) 削除/引用 No.11250-8 - 2023/03/07 (火) 09:48:13 - ちょっと 774Rさんのコメントは強烈な不快感を感じる。 匿名だからといって発言には気をつけなよ。よくそんなことを書けるな。

(無題) 削除/引用 No.11250-7 - 2023/03/07 (火) 06:06:46 - おお 普通クローンを一つしか拾わないというのはしないので、少し不思議な質問ですね。それともどれを拾っても同じところに変異が入ってたとか言う話なんだろうか？そのばあいテンプレートがあやしい。

(無題) 削除/引用 No.11250-6 - 2023/03/06 (月) 22:22:19 - G25 600 bpのPCR産物をクローニングして、たまたま見た一個にエラーが一個あったって、600 bp毎に一個のエラーがあるということじゃありませんから。 あと100クローン見たらみんなエラーがないかもしれない。エラー率10^-5オーダーとかなら、そんなもんじゃないでしょうか。 ここにエラー率の例のテーブルがありますが、たとえば、 Pfuで1 kbを30サイクル増幅したとき、エラーをもつクローンの割合が8.4%です。10個に一個はエラーをもつクローンがでるって程度です。 https://www.thermofisher.com/jp/ja/home/brands/thermo-scientific/molecular-biology/molecular-biology-learning-center/molecular-biology-resource-library/thermo-scientific-web-tools/pcr-fidelity-calculator.html

(無題) 削除/引用 No.11250-5 - 2023/03/06 (月) 18:40:11 - egeria 1. 私は現在ほぼすべてのPCRをKOD Oneで行っていて、site-directed mutagenesisにも使っています。サイクル数はたいてい15です。アンプリコン領域に変異を見つけることもありますが、プライマー領域の変異のほうがはるかに多いので、オリゴDNA合成のエラー率が改善されなければポリメラーゼの精度が向上しても無意味だと思っています（なおオリゴDNAはカートリッジ精製グレードを使っています）。ですから、KOD Oneを第一選択として使うことに違和感はありません。 2. シーケンシングで確認しない限り、PCRで増幅した領域に変異が存在する可能性は常に考慮すべきだと思います。どれだけ性能が良いポリメラーゼを使ってもそれは変わりません。バックボーンの変異を完全に排除したければ、インサートの配列を確認した後に制限酵素で切り出してサブクローニングするのがベストです。

(無題) 削除/引用 No.11250-4 - 2023/03/06 (月) 18:17:20 - おお そこまで高頻度に起こる印象はないですけどね。 error ratio のデーターを見ても10万ベースに数個。600bに一つというのはTaqならあり得る数字だけど、校正活性がある酵素ではそこまでひどいことはない。ここでもよく聞くのでよく使われている酵素でしょうけど、そういう意味でも色々意見が出てくるかもしれない。 まあ違う酵素を使うなら個人の勝手でしょうからそれはいいですけど。 同等の能力が期待されるものとしては Takara prime star NEB Q5 High-Fidelity DNA Polymerases

(無題) 削除/引用 No.11250-3 - 2023/03/06 (月) 17:29:44 - G25 何クローン見ていくつに変異があったのですか？

(無題) 削除/引用 No.11250-2 - 2023/03/06 (月) 17:28:48 - 774R n=1でここまで書けるって、営業妨害かな？

KOD Oneについて 削除/引用 No.11250-1 - 2023/03/06 (月) 17:14:48 - DNA お世話になります。 あるプラスミドをPCR鋳型から60 bpほどをdeletionさせるためinverse PCR（たった15サイクル）を行いました。 その後のクローンをシークエンスしたところ、当該遺伝子（たった600 bp）内に全く関係のない1塩基置換を認めました。 敢えて、たったという言葉を使いましたが、予期せぬエラーを認めたことから、KOD Oneは結構な変異が入りやすいのではないか？と考えています。 皆さまは通常の遺伝子クローニング（プラスミド構築）のためにKOD Oneを第一選択として使うことに違和感をおぼえますでしょうか？ 600 bpの興味ある遺伝子内にiPCRとは言えど変異を認めたことから、プラスミドバックボーンにもきっと変異があるのだと思われます。。 今後8000 bpほどの遺伝子をクローニングしようとしていますが、おすすめなポリメラーゼを教えていただけますと幸いに存じます。

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