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(無題) 削除/引用 No.11248-7 - 2023/03/06 (月) 23:09:31 - ああ 僕もOrigeneから買ったプラスミドが生えなかった事あります。 問い合わせてもう一本送ってもらって、それを使ったら生えました。

(無題) 削除/引用 No.11248-6 - 2023/03/06 (月) 22:13:34 - pCMV6 皆さま、アドバイス頂きありがとうございます。 メーカーに問い合わせつつ、教えて頂いた低温培養や回復時間延ばす、カナマイシン濃度下げる、を試してみたいと思います。

(無題) 削除/引用 No.11248-5 - 2023/03/06 (月) 20:22:12 - 2ME 並行実験でコロニーが生えているなら、Origeneから来た物がダメだと考えるのが妥当な気がするのだが。速攻で連絡して交換。

(無題) 削除/引用 No.11248-4 - 2023/03/06 (月) 16:36:31 - G25 供給元のマニュアル、トラブルシューティングはみてみた？ Kanは25 ug/mLになってますね。まあ、二倍濃いくらいでまるっきりだめになることは無いと思うけど。 Kan選択なので回復培養を長めにとると良いかもしれない。プラスミドの増殖や耐性遺伝子の発現が低い場合もあるかもしれない。１時間のところ3時間くらいにしたら、コロニー数0だったのがいくつか生えるようになることはある（つまり１時間で耐性になったものが、延長した回復培養中に増殖してコロニー数が増えたってわけでもなさそう）。 このベクターに限らずありがちですが、宿主にとってtoxicな遺伝子が組み込まれているため生えないトラブルがあって、培養温度を下げたりしますが、 トラブルシューティングにもこうあります。 Should a gene be toxic to the cells, growing bacteria at a lower temperature, such as 300C or transforming into strains that reduce the copy number can increase the odds of obtaining colonies (i.e. ABLE-C or ABLE-K strains from Stratagene; CopyCutter from Epicentre).

(無題) 削除/引用 No.11248-3 - 2023/03/06 (月) 05:13:15 - おお あ、オリジーンに問い合わせるならどの菌株のコンピを使っているかも聞いておくといいかもしれない。

(無題) 削除/引用 No.11248-2 - 2023/03/06 (月) 05:07:27 - おお 一度購入先に問い合わせください。 インサートやその繋ぎ具合で大腸菌の増殖に影響出たりすることはたまにあります。そのため増殖が遅く後半日ぐらいしないと明らかなコロニーが確認できないとかいうこともあります。 さらにこの観点でいじるなら、カナマイシンの濃度を15ug/mlあたりまで下げて(一応バックグラウンドのチェックが必要かも知れない)プレートも室温から30度くらいでコロニーをけいせいさせる。これらの工夫は大腸菌内のプラスミドコピー数を低減するためのもので、大腸菌への悪が減るだろうと言うこと。 もう一つは大腸菌株との相性で、こういう悪さに対して感受性が低いものもあれば高いものもあって、一概にどれが強くてと言うのははっきりとしたことは言えないにしろ、菌株を変えたら増えてきたと言うこともあります。

大腸菌のコロニーが生えない 削除/引用 No.11248-1 - 2023/03/05 (日) 21:18:35 - pCMV6 OrigeneからpCMV6-Entryプラスミドに遺伝子ORFが入ったベクターを購入しました。 ベクターを増やそうと思ってDH5 alphaに入れてカナマイシンプレートに蒔いたところ、コロニーが全く生えなかったためプラスミド入れた大腸菌を増やせませんでした。 具体的な手順は以下の通りです。 ＞水に溶かしたプラスミド100ngをDH5 alpha (Takara Bio製）約100uLに加えてon ice 30 min ＞42度で45秒間加温 ＞氷上で冷やして、SOC 1mL加えて37度で1時間振盪培養 ＞遠心してペレットを50uLのSOCに懸濁して50ug/mLカナマイシン含むLBプレートに播種 ＞37度で一晩培養 並行して他のカナマイシン耐性ベクターを使ってライゲーション実験しており、同ロットのコンピテントセルとカナマイシンプレートを使用していますが、そちらの実験ではコロニーが生えています。 プラスミドはシークエンスは確認していませんが、制限酵素3種類で消化して電気泳動したところマップと一致するバンドサイズで、目的遺伝子の発現も正常でした。 目的の遺伝子ORFは入っているようなので切り取って他のベクターに移してもよいのですが、使えるものならこのベクター（pCMV6）を増やしたいと思っています。 改善点をアドバイス頂けないでしょうか。よろしくお願いします。

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