BioTechnicalフォーラム [DNAシークエンス用のユニバーサルプライマーの特異性について]

DNAシークエンス用のユニバーサルプライマーの特異性について

No.11243-TOPIC - 2023/03/03 (金) 14:33:47 - 素人

M13やT7などのプライマーは、プラスミド内に取り込んだインサートDNAの配列を読むためのシークエンス反応に利用されています。よって、同プライマーに相補的な配列がインサートDNA中に存在すると困ります。

従って、同プライマーの結合部位の配列は、自然界には殆ど存在しないはずなのですが、その根拠となる情報が得られません。

どなたかご存知ないでしょうか。
　

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No.11243-10 - 2023/03/06 (月) 08:31:52 - 素人

みなさま

コメントありがとうございました。
理解できました。

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No.11243-9 - 2023/03/03 (金) 18:16:59 - G25

M13-RVとT7をゲノム配列に対してBLASTしてみた。
ヒト、マウスのゲノムにヒットなし。

試しに、Flybaseに行ってショウジョウバエを中心とした昆虫や蛛形のゲノムに対してblastしたら、結構100%&マッチがヒットした。

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No.11243-8 - 2023/03/03 (金) 16:23:46 - おお

人工的ではありません。勿論それらのファージにはその配列がありますので、それらのファージ由来のDNAならばプライマー相当の配列がないとわかっていない限り使わないというのは無難なやり方です。

そもそも、T7やM13のプライマーでないと配列が読めないわけでもなく、上手く読めないなら違う箇所の配列からプライマーを作って読むことはありますし、大抵の人はフレキシブルにやっていると思います。また、CMVプロモーターを持った発現ベクターで、CMVプロモーターの部分に配列が読めるプライマーを設定しているメーカーもあります。

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No.11243-7 - 2023/03/03 (金) 15:45:43 - AA

T7もM13もファージの名前であり、それぞれが由来であることは自明だと思いますが・・・

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No.11243-6 - 2023/03/03 (金) 15:31:09 - 素人

コメントありがとうございます。

更に言えば、ユニバーサルプライマー結合部位の配列は、人工的にデザインされたものなのでしょうか。それとも、プラスミドの由来となったファージ等に固有のものなのでしょうか。

前者であれば、コメントいただいたブラスト結果と確率論で、高い特異性が予想されると思います。

後者であれば、シークエンス反応時に使うユニバーサルプライマーの特異性は、インサートDNAの由来が該当するファージ等であれば、低くなる可能性が考えられます。

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No.11243-5 - 2023/03/03 (金) 15:05:19 - おお

自然界に存在しないという証明ができる方法があるなら教えて欲しい。

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No.11243-4 - 2023/03/03 (金) 15:03:17 - おお

ブラストサーチでヒトのゲノムからは20塩基中16マッチが最長でしかも3‘が一致してないので伸長反応もおきない。

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No.11243-3 - 2023/03/03 (金) 15:00:47 - 774R

計算間違えたorz
4の20乗＝約1x10^12

1兆分の1でした。