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植物成熟種子のパラフィン包埋 トピック削除
No.11238-TOPIC - 2023/02/27 (月) 17:11:59 - う
お世話になっております。
発芽過程の種子を用いたin situ hybridizationをしたいのですが、種子の中にパラフィンが浸透せず切片の作成がうまくできません。

現状は、
FAA溶液（10 % formaline, 50 % EtOH, 5 % acetic acid, 35 % dH2O)で数回脱気した後overnight→50 % EtOHに置換し10 min 静置 → 新しい50 % EtOHに置換 (×4回）→ 50/40/10 dH2O/EtOH/t-BtOH 1時間→30/50/20 dH2O/EtOH/t-BtOH 1時間→15/50/35 dH2O/EtOH/t-BtOH 1時間→ 0/45/55 dH2O/EtOH/t-BtOH 1時間→ 0/25/75 dH2O/EtOH/t-BtOH 1時間→ 100 % t-BtOH overnight→新しい100 % t-BtOH→50 % パラプラスト (in t-BtOH) overnight →100 % パラプラスト overnight→100 % パラプラスト overnight→包埋

としました。
種子には切れ込みをいれたものといれないものを作りましたが、どちらもうまくいきませんでした。また、固く小さいため切れ込みを入れるのが難しく時間もかかるため、うまくいくなら切れ込みを入れずにできるといいのですが…。
条件検討を行うにあたって、どの部分から検討するのがよいでしょうか？（t-BtOHの置換にかける時間など？）
また、プロトコルを調べると、t-BtOHでなくキシレンを使用しているものやHistClearを使用しているものなどありますが、これらの溶媒を使用する方が浸透しやすいなどあるでしょうか？

どうぞよろしくお願い致します。
　
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植物成熟種子のパラフィン包埋 削除/引用
No.11238-1 - 2023/02/27 (月) 17:11:59 - う
お世話になっております。
発芽過程の種子を用いたin situ hybridizationをしたいのですが、種子の中にパラフィンが浸透せず切片の作成がうまくできません。

現状は、
FAA溶液（10 % formaline, 50 % EtOH, 5 % acetic acid, 35 % dH2O)で数回脱気した後overnight→50 % EtOHに置換し10 min 静置 → 新しい50 % EtOHに置換 (×4回）→ 50/40/10 dH2O/EtOH/t-BtOH 1時間→30/50/20 dH2O/EtOH/t-BtOH 1時間→15/50/35 dH2O/EtOH/t-BtOH 1時間→ 0/45/55 dH2O/EtOH/t-BtOH 1時間→ 0/25/75 dH2O/EtOH/t-BtOH 1時間→ 100 % t-BtOH overnight→新しい100 % t-BtOH→50 % パラプラスト (in t-BtOH) overnight →100 % パラプラスト overnight→100 % パラプラスト overnight→包埋

としました。
種子には切れ込みをいれたものといれないものを作りましたが、どちらもうまくいきませんでした。また、固く小さいため切れ込みを入れるのが難しく時間もかかるため、うまくいくなら切れ込みを入れずにできるといいのですが…。
条件検討を行うにあたって、どの部分から検討するのがよいでしょうか？（t-BtOHの置換にかける時間など？）
また、プロトコルを調べると、t-BtOHでなくキシレンを使用しているものやHistClearを使用しているものなどありますが、これらの溶媒を使用する方が浸透しやすいなどあるでしょうか？

どうぞよろしくお願い致します。
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