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(無題) 削除/引用 No.11236-13 - 2023/03/18 (土) 02:47:07 - おお Whatman Nytran SuPerCharge (SPC)を買い直しました。結果この膜は低分子の吸着がHybond N+より強い（非変性条件で）ことを再認識しました。またこの膜でTransfer前に変性をかましたものと変性せずにTransferしたものでは（Side by sideではないですが）、Transfer後のメチレンブルー染色(marker)では両者見栄えは一緒でした。変性しなくとも吸着力はあるようです。 検出はSA-HRPを使っていますが、バックグランドである意味苦労しましたが、チャージの強さなどで吸着力が強いことが影響しているかもしれません（チャージをなるべく減らすために１M NaClで反応させてます）。

(無題) 削除/引用 No.11236-12 - 2023/03/04 (土) 09:46:59 - G25 Rocheのマニュアル見つけて読み返したら、 先に書いたトランスファの方法(contact blot)もelectro-blotも併記されていて、electro-blotが最良の結果がえられるとありました。 https://www.google.com/url?sa=t&rct=j&q=&esrc=s&source=web&cd=&ved=2ahUKEwjmkNLhgsH9AhUJr1YBHQD0CDMQFnoECCUQAQ&url=http%3A%2F%2Fwww.protocol-online.org%2Fforums%2Fuploads%2Fmonthly_01_2010%2Fpost-15212-1263167826.ipb&usg=AOvVaw3Vq0QCB6fEm0si7iL76vPg まあそれでも、条件やメンブレンの選択によっては、すっぽ抜ける危険性はありますけど（Hybond-N+での経験は先に述べましたが）。

(無題) 削除/引用 No.11236-11 - 2023/03/04 (土) 09:27:03 - G25 >Rocheのシステムのプロトコールでは泳動後のポリアクリルアミドゲルにメンブレンとろ紙を重ねて、ゲルに含まれる泳動バッファだけでトランスファするという方法だったと記憶します。 ゲルの反対側のガラス板はつけたままでです。 オプションとして、ガラス板-ゲル-メンブレン-ろ紙ごと、ハイブリバッグに入れて減圧するというのもあった気がする。

(無題) 削除/引用 No.11236-10 - 2023/03/04 (土) 09:13:31 - G25 ポリアクリルアミドゲルをエレクトロブロットするという話でしたか。 私は通常のSouthern，Northernでアガロースゲルで、キャピラリーあるいはバキュームブロットする場合を想定していました。 PAGEでもキャピラリーブロットは可能です。 エレクトロブロットだとかえって核酸がスっぽ抜けて減弱すると思います。 トランスファバッファも電気的な制限がありますし。 ポリアクリルアミドゲルのキャピラリーブロットは、non-RIでGel shift assayする系なんかで使われていました。Rocheのシステムのプロトコールでは泳動後のポリアクリルアミドゲルにメンブレンとろ紙を重ねて、ゲルに含まれる泳動バッファだけでトランスファするという方法だったと記憶します。 アガロースゲルでキャピラリーブロットするみたいに、トランスファバッファを供給しながらペーパータオルで吸い取るというのももちろん行けると思います。あるいはゲルを好みのトランスファバッファに置換して、ゲルに含まれるバッファだけでトランスファするというのも可能でしょう。

(無題) 削除/引用 No.11236-9 - 2023/03/04 (土) 08:31:07 - おお >[Re:7] G25さんは書きました : > Hylond-N+, Biodyne B/plusのようなポジティブチャージのメンブレンはアルカリトランスファでこそ高い結合力を発揮します。すなわち、0.2 M あるいは0.4 MのNaOHを転写液にするわけで、必然的に一本鎖に解離変性します。 そうですねぇ、、、アルカリで電気泳動する方法もあるので、アルカリで電気的にトランスファーしてみようか、、、そういうプロトコールは見たことがないけど、、、、そうすると多分NaOHは５０mM以下で塩は加えられない。泳動で通常よりも結構電流が流れるらしいけど、、、 > 非変性で転写するときはSSCが使われます。20X, 10X, 2Xなど様々な濃度のプロトコールがありましたが、RNAブロットで比較したところ20Xが最優秀。10Xになるとだいぶ補足効率が落ちます。 そうですね。この場合はPAGEなんですけどキャピラリ方式でということになりますね。 > > > 記憶が正しければ、Biodyne plusのポアサイズはBiodyne Aなんかより大きかったはず（0.4 um vs 0.2 um)ですが、核酸の捕捉効率は優れていて、ポアサイズはあまりクリティカルな要因じゃないようです。 ありがとうございます。Nytran SuPerCharge (SPC) もたしか０.４だったと思います。

(無題) 削除/引用 No.11236-8 - 2023/03/03 (金) 09:47:05 - AA non-RIの標識だとイマイチ感度が上がらず、RIは諸々の制度・規定で使いにくい、ということもあってやってません。 遺伝子改変をしたときとか、本当はやった方がいいという場面もあることにはあるんですが。。。

(無題) 削除/引用 No.11236-7 - 2023/03/03 (金) 09:40:51 - G25 Hylond-N+, Biodyne B/plusのようなポジティブチャージのメンブレンはアルカリトランスファでこそ高い結合力を発揮します。すなわち、0.2 M あるいは0.4 MのNaOHを転写液にするわけで、必然的に一本鎖に解離変性します。 チャージ無しのナイロンではこれに更に1.5 M程度のNaClを加えますが、ポジチブチャージの製品にはNaClは必要ないと言う記述もあります。しかし、私の経験ではやっぱりNaClがあったほうが成績がいいです。 非変性で転写するときはSSCが使われます。20X, 10X, 2Xなど様々な濃度のプロトコールがありましたが、RNAブロットで比較したところ20Xが最優秀。10Xになるとだいぶ補足効率が落ちます。 また、Hybond-N+（formula変更前の製品）とBiodyne plusを side-by-sideで比較したことがあります。二枚重ねでトランスファしてみると、Hybond-N+は結構スっぽ抜けて二枚目にも検出されるのに対し、Biodyne plusは一枚目に濃く検出されて二枚目には全く検出されませんでした。記憶が正しければ、Biodyne plusのポアサイズはBiodyne Aなんかより大きかったはず（0.4 um vs 0.2 um)ですが、核酸の捕捉効率は優れていて、ポアサイズはあまりクリティカルな要因じゃないようです。

(無題) 削除/引用 No.11236-6 - 2023/03/03 (金) 01:58:43 - おお コメントありがとうございました。新しく購入するまではWhatman Nytran SuPerChargeがラボにあったのでそれを使ってました（たしか）。それを切らして同商品の価格を見たら全体的に他の商品と５割増程度の価格でしたので、まあどこもそんなに変わるもんでもないだろうとおもいHybond N+にしたんですが、、、変性してない１００から５００bpsのあたりの付きが悪くて使いづらいという感じです。 むかしRealTimePCRが普及してないころPCRサザンをやっていた人がいまして、まあそれではHybond N+はそんなに問題になってないようでしたが、今やっている検出感度レベルではどうしようもないような。。。違いといえばキャピラリー式のトランスファーか電気的で違いがあるのかもしれませんがよくわかりません。もう一つ考慮できそうなところは変性してからトランスファーするかどうかで変性したほうが効率がいいだろうと思いますが、ステップが増えないように変性せずとも吸着してくれるポジチャージのものを選んだわけで、、、どうするかなぁって思っています。 Biodyneはよく聞く商品ですね。学生の頃通常のサザンやノーザンで教授にどの商品がいいですかと聞いたら、Biodyneがいいと教えてくれたのを思い出します。 あと気になる商品がいくつかあって一つはバイオラッドのゼータプローブだったっけか、、、商品謳い文句では短い核酸でも保持能力に優れていると書かれています。実際のパフォーマンスがわからないのでどうかなぁと、、、また無名のメーカーが０.２umポアサイズのものを売ってたりしますが、、、まあ小さい方が密度的にも吸着に有利と思いますが、いかんせんこれもパフォーマンスは未知数なので、、、

(無題) 削除/引用 No.11236-5 - 2023/02/28 (火) 18:32:05 - G25 前世紀中にSouthern, Nothernは散々やったクチです。 メンブレンはメーカー、ブランドによって違いが大きいです。 話によると、ナイロンメンブレンのメーカーはそんなに数は多くなく、試薬会社やブランドは違っていても、出どころは同じだったりするらしいけど、各社、オーダする仕様が違うんでしょうね。 最終的にこれで決まりとなったのはPall社のBiodyneシリーズ、特にBiodyne plusでした。これは当時、Boehringer Manheim/RocheがDIGシステム用に売っていたポジティブチャージメンブレンと出どころが同じものと聞きました。 RI標識がnon-RIに取って代わられ、DIGシステムが席巻していた頃のはなし。 対抗馬のHybond-Nとポアサイズこそ大差ありませんでしたが、より厚手であるせいか、化学組成が違うのか核酸の捕捉力は抜群、かる低バックグラウンドでした。されにHydondには悪いことに、特許に引っかかるかなんかして、化学組成の変更があって、それ以来、バックグラウンドが高くなりやすくなって、随分評判を落としました。 もし試していないなら、Biodyneはおすすめです。non-chargedのA, positive chargedのB, non-RI向けに性能を高めたplus、まだ製造されていると思います。

(無題) 削除/引用 No.11236-4 - 2023/02/28 (火) 02:38:10 - おお 数十ですか。ほぼ絶滅危惧種ですね。。。みんなやってよ。 マイクロRNAの論文ありがとうございました。マイクロRNAの検出系（PCRなど）方法論が試行錯誤されている最中はブロッティングのイメージをよく見ました。実はさいきんPCR産物をブロッティングする系を使のが良さげな実験系を組みました。PCR産物はたいてい１００から３００bpsなのですが昔からおいてあるポジチャージナイロンメンブレンを使ってたときはTransferは遜色なかったのですが、新しく購入したもの（メーカーが違うのですが）ではあまりついていません。メーカーによってそんなに違いが出るのかとちょっと驚いてはいます。そういうわけで短い核酸をブロッとしているひとはいないかなぁと、、、

(無題) 削除/引用 No.11236-3 - 2023/02/27 (月) 12:32:29 - あの 中身を読んでいませんが、次のようなのありますね https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/36689175/

(無題) 削除/引用 No.11236-2 - 2023/02/27 (月) 12:29:36 - あの 当方は全くしません。 なお"Southern blot" あるいは　"Northern blot" 、ならびに、2023や2022でPubmedで検索したら数十はヒットしますね。

核酸のブロッティング 削除/引用 No.11236-1 - 2023/02/26 (日) 10:08:06 - おお 最近核酸のブロッティングしてますか？ 流通してないせいか、なんかちょっと高いかなぁ、、、 あとmicroRNAなど扱っている人でブロッとしている方はどこのメンブレンを使っているでしょうか？

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