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(無題) 削除/引用 No.11218-11 - 2023/02/20 (月) 19:03:57 - G25 処理できる培養スケールは制限があるけど、それに比べるとカラムのキャパはまだ余裕があるってとき、 一旦、キットなしのAlkali/SDS法で粗精製（酢酸塩で塩析後、アルコール沈殿）したプラスミドを出発材料にしてキットで精製すると良いかもしれない。 ただし、もうalkali lysisは必要ないばかりか、プラスミドを変性させる可能性があるから、NaOHを含んだ液（いわゆるSoln 2)がダイレクトに入らないように工夫する必要はある（Soln3を先にいれあとからSoln2を入れるとか）。 mini prepの場合だけど、わたしは、基本的にキットなしで精製しますが、あとで精製度を高める必要になれば、精製済みのプラスミドをmini prep用のカラムキットにかけることがある。 キットなしでやって多サンプルをざっとみてから、大事なやつだけカラムで再精製するとか。

(無題) 削除/引用 No.11218-10 - 2023/02/20 (月) 01:07:02 - おお > 200~300mLのMaxiprepだと4分割しないといけないので、操作が煩雑かなと感じております。 カラム再生というのもありなのかも知れません。四分の一を乗せて、溶出後1MHClを通して水で洗った後平衡化して残りを乗せる。カラム再生は以下の論文では9回やっても終了はかわらないようです。同じプラスミドを精製するならキャリーオーバーも問題にならないし、HCl通せばいいくらいで再生も厳格にやる必要もないでしょう。 https://www.future-science.com/doi/10.2144/000112327 > 3)P1~P3バッファが古典的なものとほぼ同じということで、もしロスしてバッファが足りなくなっても、自作で代用できそう。 どうしてもキットなのですね。

(無題) 削除/引用 No.11218-9 - 2023/02/19 (日) 13:56:40 - AAA 皆様多くの情報ありがとうございます。 ここまでの情報では、キアゲンのエンドトキシン除去可能なmega prep kitがよいのではないかと思っています。 1)やはり老舗なので、突然生産中止になったりする心配がなさそう 2)maxi prepで2-3mgとれるのであれば、megaperepの公称値で2.5mg maxとなっているが、実際には3-5mgくらいはとれそう。 3)P1~P3バッファが古典的なものとほぼ同じということで、もしロスしてバッファが足りなくなっても、自作で代用できそう。

(無題) 削除/引用 No.11218-8 - 2023/02/18 (土) 02:02:11 - おお >[Re:2] おおさんは書きました : > キットを使わないと言う選択肢もあるけどね。LPSはTRITONX 114でかんたんにぬけるし。あるいはイオン交換カラムにつけてTRITONx100のか言ったバッファーで洗うか。 因みに、QiagenのP1、P2、P3のバッファーは、昔から有るキットなしで精製するプロトコールで使うバッファーとほぼ一致しています。要するに昔からある方法をそのまま使っている。

(無題) 削除/引用 No.11218-7 - 2023/02/17 (金) 23:38:56 - G25 キャパが3 mg あるならMaxiでもいいというなら、Qiagenよりこっちの方が性能が良く、値段もやややすい(使用者の感想です)。 https://www.funakoshi.co.jp/contents/65412

(無題) 削除/引用 No.11218-5 - 2023/02/17 (金) 22:31:36 - 散々 キアゲンのMaxiキットでも、実際は２から３ mgは取れる。

(無題) 削除/引用 No.11218-3 - 2023/02/17 (金) 14:46:49 - G25 Endotoxin除去のステップ、最近はそれ用のカラムを通すとか効果的で垢抜けてる製品もある中で、ちょっと泥臭い感じもするんだけど、老舗だしQiagenでいいんでない？ 一回1万円くらいで値段もまあまあ。 https://www.qiagen.com/ja-jp/products/discovery-and-translational-research/dna-rna-purification/dna-purification/plasmid-dna/endofree-plasmid-kits?catno=12381

(無題) 削除/引用 No.11218-2 - 2023/02/17 (金) 14:17:43 - おお キットを使わないと言う選択肢もあるけどね。LPSはTRITONX 114でかんたんにぬけるし。あるいはイオン交換カラムにつけてTRITONx100のか言ったバッファーで洗うか。

MegaPrepのおすすめkit 削除/引用 No.11218-1 - 2023/02/17 (金) 12:28:43 - AAA いつも勉強させてもらっています。 MegaPrepのおすすめのキットについて相談です。 私の実験系ではレポータ遺伝子のプラスミドをトランスフェクションで日常的に使うので、年に1-2回、エンドトキシン除去可能なMegaPrepで大量に精製してストックしていました。 久しぶりに行おうとしたら、いつも使っているBiomiga社のMegaprepキットが製造中止になっていました。 皆さんのおすすめのMegaprepキットはありますでしょうか？ いつも行なうときは ハイコピーのプラスミドを入れた大腸菌を 1LのLB-ampで一晩培養し、 Megaprep kitで抽出精製 最終の収量は3~5mg程度といったところでした。 適したキットを探しているですが 2L~スケールのGigaprepになってしまうと大きすぎて、もったいない気がするのと 200~300mLのMaxiprepだと4分割しないといけないので、操作が煩雑かなと感じております。 もしおすすめのMegaprep kitがありましたら、ご教示いただけますでしょうか（エンドトキシン除去可能だとベストです）。 もし1L程度のスケールでMaxiprep数本に分けて行っているなどの情報がありましたら、それも教えていただけると助かります。

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