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(無題) 削除/引用 No.11217-13 - 2023/02/19 (日) 11:36:47 - おお >[Re:12] おおさんは書きました : > そもそも、ちゃんと光っているのかも気になるところです（どれくらいがポジティブとか）。フローサイトのソーティングもとりあえず流してそのポピュレーションのなかで強そうなものとか選んでいるなら、シグナルでなくてノイズの範囲で強いポピュレーションを見ているだけかもしれない。 そういえば、Oct-GFPのレポーターで蛍光陽性の細胞を取ってきたが、細胞死などで見られる自家蛍光であろうと言うことになった話がありましたね。

(無題) 削除/引用 No.11217-12 - 2023/02/18 (土) 10:40:50 - おお そもそも、ちゃんと光っているのかも気になるところです（どれくらいがポジティブとか）。フローサイトのソーティングもとりあえず流してそのポピュレーションのなかで強そうなものとか選んでいるなら、シグナルでなくてノイズの範囲で強いポピュレーションを見ているだけかもしれない。いちどちゃんと光るコンストラクトでどの程度かというのを把握するかSide by sideでやって閾値を決めるかするのが普通だろうなと思うけど、どうしてるんだろう。トランスフェクションの効率も一度確認しておくべきだと思うし（２９３Tならほぼ１００％入ってもおかしくないので５０％ぐらいならTrarnsfectionがあまり良くないと言ってもいい）。 また元々のプラスミドが傷んでいて細胞内でどんどん削られているのかもしれないし、GFPポジなのにGFP遺伝子が見つからないというのがまずありえない訳で、各ステップごとの確認作業が必要だと思います。そうして実験を進めないのであればやる気がないとしか思えないか、向いてないのでほっとくしかないでしょうね。その人より上の人が一つづつ確認、指示ができるような人なら別ですけど。 あと雑にDNAを抽出しているなら、ゲノムにインテグレートされたT-antigenを発現するためのプラスミド配列からAmpと大腸菌用OriがTransformationを持っていて大腸菌で増えたとかいう話だったりもするかもしれない。あるいはどこかでコンタミしたプラスミドが大腸菌で増えているだけかもしれない。

(無題) 削除/引用 No.11217-11 - 2023/02/18 (土) 08:05:53 - TFP 皆様、大変有益なご助言、重ね重ね誠にありがとうございます ウイルスゲノムDNA抽出については寡聞にして存じませんでしたが、ためになりました。 正直、ヒト細胞からのDNA抽出は（大腸菌ほどではないにせよ）普通にやられてるという印象を元々持っていたのですが、一連の話で何となく思った「あまりやられていない」というのはただの誤解で、やっぱり伝統的にやられていたんですね 本題に戻りますと、実際Amplicon seqも発注したようなのですが（大腸菌に戻す前のプラスミド抽出溶液を直接使って）、結構大量のサンプルを送ったのに、目的のランダム領域が全く増えてこなかったというどうしようもない状況に陥っているようです 大腸菌に戻してプラスミドをチェックするというのも、そのAmplicon PCR解析の前段階として行っていた（プラスミドはちゃんと取れているか？サンガーseqでいくつか読んで、ランダムプールの多様性はちゃんと見られるか？など）はずなのに、結局プラスミドチェックもあやふやのまま見切り発車でAmpliconを行って全滅という感じで、袋小路に迷い込んでいる形ですね ただ一応、改めて例のアガロースゲル写真について確認してみたら、制限酵素でGFPが切り出されるように2 cutして流したものということでした なのでサイズの違いは確かなものといえる形ですけど、短い方はGFP断片が見られなかったため、ほとんどのプラスミドで肝心のGFP領域が失われているようです （制限酵素について質問するまで、本人はそのことに気付いていませんでした） 「コロニーPCRで確認したんじゃなかったっけ？」と聞いたら「この時はやらずにミニプレした」というしょうもない返答が返ってきて、「でもAmplicon用にアダプター付きプライマーで増やしたものは、バンドが見られたんだよね？」と追加で尋ねたら「見られたけど、サイズが正しいかどうかは正直定かじゃなかったかも」という、「うーん、何かもう、何だかなぁ…」って感じで、同じラボとはいえ直接関係があるわけではないので、申し訳ないけどもう相手にしてらんないわ…って感じです （こんな所で愚痴っても仕方ないですが、その方はポスドクだけどPhDではなくMDのみ保有で、とにかく思考が遅く浅く、手も雑で汚いという、正直「この人は実験に携わってはいけない」と思える方なのですが、自分はPIでもないし、そもそも偉そうにいえるほど実験や研究手技に優れているわけではないものの、最近の新任ポスドクのレベルがあまりにも低すぎるのは、どうにも気にかかる所です。 ボスは優秀だし、質問すれば何でも答えてくれるんですけど、その人は優秀じゃないのに「トップに質問する」ということを躊躇うタイプ（というか、失敗を報告したくないタイプ）で、総合して「うーん」と思えてやまない感じです。ちなみに、日本ではなくアメリカの話になりますが…） 無駄に脱線してしまいましたが、774Rさんのご指摘、実は結構気になっている部分でした。 まさしくヘテロなプラスミド集団を加えているという状況なんですけど、必ずしも1細胞1プラスミドとは限らない（というかその可能性の方が低い）でしょうし、ソートしても、蛍光強度で特定配列の効果を上手く判別できるわけではない状況といえそうですね… まぁ現状はそれ以前の問題なのですが（なぜかGFPが欠損した(?)短いプラスミドばかりが回収され、PCRすらまともにかからなかった）、機会があればその点も議論してみようと思います （ほとんど関係ない愚痴のような）長文、誠に失礼いたしました。改めてご協力いただけた皆様にお礼申し上げます

(無題) 削除/引用 No.11217-10 - 2023/02/18 (土) 04:21:53 - おお >ソーティングして、GFP+/-でどういう配列が入っているのかをチェックしたい、って感じです。 PCRでも良くない？こういうのは確かに色々な配列が交じるから２次、できれば３次スクリーニングは必要かと思うけど。その未知の配列の部分をプライマーで増やせるようにした上でカセットにしておいて、PCRした部分を再度プラスミドに入れてエンリッチしたライブラリーを作る。最後はクローニングベクターにLigationしてここのコロニーの配列をよむ。DNAseqでもいいし、長さが短ければコンカテマーにしてコロニーをひろって読めば１００bpsくらいなら１０個くらいは読めるはず。

(無題) 削除/引用 No.11217-9 - 2023/02/17 (金) 16:18:58 - 774R なるほど！配列未知でGFP蛍光でソーティングして、あとから配列を確認するのですね。つまりヘテロなプラスミドのmixtureを細胞に入れてるという理解であってます？ 一つ気になった点は、私は普段、3種類のプラスミドとか、多い場合で4つをco-transfectionすることもありますが、かなりの確率で全部入ってます。 プラスミドとトランスフェクション試薬の1つのcomplexの中には何十個とかのレベルでプラスミドが入ってると思われます。 ソーティングで得られたプラスミド集団の中には、結構な割合で欲しくないものが混じってるんじゃないかと思いました。

(無題) 削除/引用 No.11217-8 - 2023/02/17 (金) 14:22:51 - おお >[Re:6] TFPさんは書きました :いう形の実験でした。 > ランダム配列を含む > > 案外ヒト細胞からのプラスミドDNA再抽出はやられていないようで、結構難儀な実験のようですね。 > エピソーマルに増えるウイルスのゲノムを細胞から抽出する常套手段です。

(無題) 削除/引用 No.11217-7 - 2023/02/17 (金) 12:05:45 - momo ランダム配列部分だけPCRで増幅してしまうのが早いように思います。

(無題) 削除/引用 No.11217-6 - 2023/02/17 (金) 11:35:06 - TFP おおさん、774Rさん、改めて誠にありがとうございます。 やはりそんなに自然にというか当たり前のように起こるイベントでもないですよね。 逆にそんな機構があったら何か上手いこと応用できそうな気もしますし、やっぱり手技の問題じゃないかなぁ、なんて思えます。 （特にそうなる手技上の問題も浮かびませんが…） ご紹介いただいた抽出法、そこまで工夫がされているようにも見受けられなかったものの、制限酵素処理は妙案ですね。 機会があったら自分でも試してみようと思います。 774Rさん、実はGFPの方にちょっと細工を加えていまして、一応、その細工によってGFPの発現がどうなるかを見てみたい…という形の実験でした。 ランダム配列を含むので、ソーティングして、GFP+/-でどういう配列が入っているのかをチェックしたい、って感じです。 案外ヒト細胞からのプラスミドDNA再抽出はやられていないようで、結構難儀な実験のようですね。 上手く解決するといいのですが…。

(無題) 削除/引用 No.11217-5 - 2023/02/17 (金) 10:56:35 - 774R なぜそんな実験をやったのか、動機の方が気になります。

(無題) 削除/引用 No.11217-4 - 2023/02/17 (金) 10:22:07 - おお doi.org/10.1093/nar/27.2.426 よほどのことがない限り（インテグレートしたとか）、サイズは変わらないと思います。 Episomal DNAはHirt Extractionというのがあってたとえば https://www.med.upenn.edu/robertsonlab/assets/user-content/documents/Hirt%20supernatent%20DNA%20preparation.pdf

(無題) 削除/引用 No.11217-3 - 2023/02/17 (金) 08:50:53 - TFP おおさん、どうもありがとうございます。 今回の個別事象ではなく一般的にあり得ることなのかどうかを聞きたかったので適当極まりない形にしてしまいましたが、とりあえず分かる範囲で書いてみると… DNA抽出はLysisバッファー→フェノクロ……だけでは汚すぎたようで、その後カラムを使ったミニプレを実施していました。 その後大腸菌に入れて増やし、ミニプレ後、流石に制限酵素で切った後にアガロースに流しているんだと思いますが少なくとも「12サンプルのうち、１つだけ本来の長さで、残り全てが数kb短い」ゲル染色写真だけ見せてもらった感じです。 （同じように処理して取得してきたはずのプラスミドで明白に違ったので、制限酵素処理もしているものだと思いこんでいましたが、正直そこまで頭の回る人でもないですし、もしかしたら制限処理はしていないのかもしれません。 同じように処理したのに1つだけラセン状態が違うとかってありえますかね…？） ネガコンは（プラスミドありなしという意味では）全くないと思います。 プラスミドは、pcDNA3.1にGFPを挿入したものなので、SV40oriありですね。 確か大腸菌からミニプレ前にコロニーPCRをしていたような気がするので、GFP断片自体はあるんじゃないかって気はしますが、何分めちゃくちゃ手が汚い人なので、そこはやや不明瞭かもしれません（とにかく全体的に雑なので、個人的にはコンタミあるいは何らかの手腕ミスを一番疑っているのですが、でもほとんどのプラスミドがサイズ小＆そのままのサイズのプラスミドも一応検出されている…というのは腑に落ちないというか、軽く質問されたときに論理立った返答をしてあげることができませんでした）。 TF後は多分オーバーナイト後にソーティングにかけていたと思いますが、HEKの培地に抗生物質は加えていません。 同じラボでも直接関係する人じゃないので詳細が若干漠然としており恐縮ですが、個人的に気になったので質問させていただいた次第です。 何か懸念点や落とし穴がありましたらまたご教示いただけると幸いに存じます。

(無題) 削除/引用 No.11217-2 - 2023/02/17 (金) 07:21:43 - おお いや、詳細を聞いてください。DNAはどのように抽出したのか、その後大腸菌に入れたのかどうか、検出はどうしたのか、ほんとに制限酵素を使ったのか、ネガティブコントロール（調べ方によっては必要）はあるのか？プラスミドにSV40oriが入っているのか？制限酵素で切ったとしてGFPの発現ユニットはすべて残っているかと思われるサイズか？TFしてから何日立っているのか、抗生物質のマーカーは使ったのか、 でないと答えられません。

トランスフェクションしたプラスミドのサイズが変わる 削除/引用 No.11217-1 - 2023/02/17 (金) 06:38:45 - TFP HEK293T細胞にプラスミドDNA（GFP発現）をトランスフェクションし、その後セルソーティングを行い、GFP+/-細胞を回収後プラスミドDNAを抽出しました。 結果、大半のプラスミドDNAのサイズが数kb小さくなっていることが確認されたのですが（小さくなったものは、全て同じサイズ。実は自分ではなく同じラボの新人の方がやった実験なので、詳細までは聞いていないのですが、普通に制限酵素カットしたプラスミドをゲルで見た上での判断だと思います）、そんなこと（細胞にTFしたプラスミドが、再構成だかされて、サイズが変わる…？）って起こりえることなのでしょうか…？ ヒト細胞からプラスミドDNAを回収した経験が自分にはないためよく分からないのですが、経験のある方、情報をいただけたら幸いに存じます。

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