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マウスIRSのウエスタン トピック削除
No.11210-TOPIC - 2023/02/16 (木) 04:01:23 - 凛
マウス骨格筋を対象に総IRSとリン酸化IRSをウエスタンブロットで評価しています。下記の条件で試してみましたが該当するサイズのバンドが得られなかったので、下記から気になる作業工程やおすすめの抗体ありましたらご指摘、ご紹介いただけませんでしょうか。なお、下記の流れでGAPDHはシングルバンドが検出できました。よろしくお願いします。

組織：Quadriceps (採取後すぐにドライアイスで凍結し-80℃保存)
抽出バッファ：RIPA＋Proteinase phosphatase inhibitor cocktail
破砕：Qiagen Tissue Raptor + beads (たんぱく質濃度 6-7 mg/mL)
変性：LDS sample buffer + reducing agent
ゲル：4-12% BOLT precast gel
アプライ量：10 ug/lane (Internal control: 0.3 ug/lane)
転写：iBlot2, 20V 7 min
ブロッキング：TOYOBO PVDF blocking agent 2h
> wash twice with PBS tween20 0.02%
1次抗体：IRS 2382S (CST, 1000 倍希釈)
p-IRS 3070S (CST, 1000 倍希釈)
2次抗体：Goat-anti rabbit IgG (1000 倍希釈）
検出：ケミルミ
　
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(無題) 削除/引用
No.11210-3 - 2023/02/16 (木) 11:47:10 - み
量的に少ないような気がします。
total lysateで勝負するなら40-50ug/ laneくらい流してみては。
骨格筋の蛋白組成なんて数十パーセントはアクチンが占めているでしょうし。

あと、普通はtotal-IRS抗体でIPしておいてblot: phospho-IRSでやっていたような気がします。

(無題) 削除/引用
No.11210-2 - 2023/02/16 (木) 07:13:14 - おお
まあ表面的には１点を除いてそんなに変とは思わないし、そう言うので見えないところは実際に横でみたりしないとわからないのでなんとも言えませんが、

＞破砕：Qiagen Tissue Raptor + beads (たんぱく質濃度 6-7 mg/mL)
抽出時の濃度が高すぎると思います。そのため効率的にすべての抽出可能なタンパクが抽出されているかちょっと疑問です。Lysis bufferを３倍ぐらい多くしてもいいように思います。

IRSはタンパクのサイズが非常に大きいと思いますが、その条件で２００kDaあたりのトランスファーの効率はどうでしょうか？６％以下のゲルかトランスファーの工夫が必要かもしれません。グラジエントゲルならマシかも知れませんけどどうだろう。

組織からの抽出かと思いますが、細胞のLysateを１レーン流してみて検出できていればやはり組織からの抽出を改善するとか、検出できなければ抗体や検出系を考えるなどある程度方針が立てやすいかもしれません。

マウスIRSのウエスタン 削除/引用
No.11210-1 - 2023/02/16 (木) 04:01:23 - 凛
マウス骨格筋を対象に総IRSとリン酸化IRSをウエスタンブロットで評価しています。下記の条件で試してみましたが該当するサイズのバンドが得られなかったので、下記から気になる作業工程やおすすめの抗体ありましたらご指摘、ご紹介いただけませんでしょうか。なお、下記の流れでGAPDHはシングルバンドが検出できました。よろしくお願いします。

組織：Quadriceps (採取後すぐにドライアイスで凍結し-80℃保存)
抽出バッファ：RIPA＋Proteinase phosphatase inhibitor cocktail
破砕：Qiagen Tissue Raptor + beads (たんぱく質濃度 6-7 mg/mL)
変性：LDS sample buffer + reducing agent
ゲル：4-12% BOLT precast gel
アプライ量：10 ug/lane (Internal control: 0.3 ug/lane)
転写：iBlot2, 20V 7 min
ブロッキング：TOYOBO PVDF blocking agent 2h
> wash twice with PBS tween20 0.02%
1次抗体：IRS 2382S (CST, 1000 倍希釈)
p-IRS 3070S (CST, 1000 倍希釈)
2次抗体：Goat-anti rabbit IgG (1000 倍希釈）
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