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(無題) 削除/引用 No.11209-7 - 2023/02/16 (木) 17:24:37 - G25 言葉足らずというか、「ぎなた読み」で誤読を招く文でした。 >KOD Oneで2 kbほどのPCRを行い、それをEcoRVカットしてその後に脱リン酸化したpcDNA3に直接ライゲーションしました ｛KOD Oneで2 kbほどのPCRを行い、それ(PCR産物）をEcoRVカットして｝、｛その後に(ライゲーション可能な平滑末端を）脱リン酸化したpcDNA3に直接ライゲーションしました} という意味にもとれます。というか、私は最初、そう読んでレスを付けたのですが、誤読に気づいて削除したのでした。 質問に即した答えは皆さんの回答通り。

(無題) 削除/引用 No.11209-6 - 2023/02/16 (木) 15:59:58 - P > > 言葉足らずでごめんなさい。ベクターはEcoRVで切断していますが、PCR産物は直接クローニングすればいいのではと考え、EcoRVで切っていません。 > > そのまま入ると思っていましたが、やはりPCR産物は制限酵素で切るように調製するか、PNKでリン酸化させないといけなかったということでしょうか？ リン酸化が必要ですね。 https://lifescience.toyobo.co.jp/user_data/pdf/upload/upload86/cloning86pc01.pdf を参照して下さい。 懐具合に問題がないならGibson assemblyなどのシームレスクローニングをおすすめします。 平滑末端クローニングはインサート方向やアタリハズレも考慮するといくつもコロニー拾うことになると思いますが、Gibson assemblyにしてからは2個拾ってほぼ百発百中です。

(無題) 削除/引用 No.11209-4 - 2023/02/16 (木) 02:37:48 - おお その場合はPCR産物の末端をリン酸化するべきでしょう。プライマーをリン酸化しておく手もあります。 あるいはそのPCR産物の末端がプラスミドのEcoRV切断箇所と繋がったとき、EcoRVの認識部位ができるようにできてますか？できてないなら、プラスミドを脱リン酸化せず、PCR産物とLigationして、Ligation ProductsをEcoRVで切断してから形質転換する手があります（セルフLigationが除けます）。ただし、当然ですがPCR産物の内部にEcoRVがあればできません。 あるいはBamHIで切ってフィルインしてからPCR産物をLigationしてClaIで切る。ClaIはDam methylationセンシティブですがフィルインしたAにはメチレーションが入ってないしpCDNA３にも切断箇所がないので PCR産物内にClaIがなければセルフライゲーションだけが除けます。（Dam methylationはGATCのAがメチル化） 気になるのはコロニーが生えないというところでコンピテントがちゃんとしてればバックグランドで数個から数十個生えてもおかしくないと思いますが、コンピテントの効率は把握していますでしょうか？

(無題) 削除/引用 No.11209-3 - 2023/02/16 (木) 01:46:08 - kod >[Re:2] Pさんは書きました : > PCR産物をEcoRVで切ってるならリン酸化する必要はありません。 > コロニーが出なかったのは、プライマーのEcoRVサイト外に余分な配列を付加していないために切断できなかったから、ではないでしょうか? > P様 言葉足らずでごめんなさい。ベクターはEcoRVで切断していますが、PCR産物は直接クローニングすればいいのではと考え、EcoRVで切っていません。 そのまま入ると思っていましたが、やはりPCR産物は制限酵素で切るように調製するか、PNKでリン酸化させないといけなかったということでしょうか？

(無題) 削除/引用 No.11209-2 - 2023/02/15 (水) 22:27:21 - P PCR産物をEcoRVで切ってるならリン酸化する必要はありません。 コロニーが出なかったのは、プライマーのEcoRVサイト外に余分な配列を付加していないために切断できなかったから、ではないでしょうか?

KOD OneでPCRした産物のリン酸化の必要性について 削除/引用 No.11209-1 - 2023/02/15 (水) 22:07:09 - kod KOD Oneで2 kbほどのPCRを行い、それをEcoRVカットしてその後に脱リン酸化したpcDNA3に直接ライゲーションしましたが、コロニーが出ませんでした。 KOD Oneで得られたPCR産物はPNKによってリン酸化しないと入らないでしょうか？ 稚拙な質問でごめんなさい。 ご存知の方がいらっしゃいましたらよろしくお願いします。

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