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RT-qPCRとRNA-seqデータの乖離 トピック削除
No.11206-TOPIC - 2023/02/15 (水) 16:30:48 - mel
いつもこちらで勉強させていただいております。

RT-qPCRとRNA-seqデータの乖離が生じることはよくあることと報告されていますが、
今回、ノックアウトマウスでノックアウトされているはずの遺伝子で、こちらの現象が生じたため、ご質問させていただきました。

今回、Cre-loxPシステムを用い、ある組織のコンディショナルノックアウトマウスを作製し、
単離したその組織におけるqPCRでは、
CT値で30と37程度と、理論的には2の7乗程度、発現が100分の1程度になっているはずなのですが、RNA-seqの結果はほとんど差がありませんでした。
カウント数を見ますと、4000万リード中1000程度でほぼ同等でした。
qPCRのCt値やRNA-seqのカウント数から考えても、
そこまで低発現遺伝子というわけでもなく、またqPCRでは明らかにノックアウトされているのでこの現象に疑問を持っております。

今回のターゲット遺伝子の全身性ノックアウトマウスでは、
臓器は異なりますが、カウントは1/10程度であったので、
RNA-seqのパイプラインによる問題よりも、
Cre-loxPシステムによる影響ではないかと考えております。

例えばCreloxP配列が1つのエクソン領域の両端に入っていたとして、
Creにより切断されると不完全なmRNAとなり翻訳されないところが、
RNA-seqではRNAを断片化するため、
Creで切り取られていない残りの断片がリードとしてカウントされる、
といったことが起こりうるでしょうか。

ただこのような現象が起こりうるとするともっと報告されていそうですが、
そのような報告は見当たりません。

こちらの現象について、suggestionなどあればご指摘いただけますと幸いです。
長文失礼いたしました。
 
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(無題) 削除/引用
No.11206-4 - 2023/02/16 (木) 02:43:12 - おお
まああまり深追いするところでもないでしょうけどカウントされた場所を遺伝子上で表示すれば切り除かれた部分がないのがわかるはず。タンパクをコードする遺伝子なら(目的によるけど)タンパクが発現されてなければよしではないでしょうか。制作したのが他の研究グループだったらその辺は(信用できるなら)確認済みでしょうし。

(無題) 削除/引用
No.11206-3 - 2023/02/15 (水) 18:04:44 - mel
おお様

重要なご指摘ありがとうございます。

qPCRではできあいのTaqmanプローブを用いていますが、
たまたまloxp配列で入っているエキソン領域内でプライマーが設計されていたため、発現量低下という結果になった、ということでしょうかね。
loxPマウスの配列情報とプライマー配列を調べてみたいと思います。

(無題) 削除/引用
No.11206-2 - 2023/02/15 (水) 16:52:31 - おお
>[Re:1] melさんは書きました :
>
>
> 例えばCreloxP配列が1つのエクソン領域の両端に入っていたとして、
> Creにより切断されると不完全なmRNAとなり翻訳されないところが、
> RNA-seqではRNAを断片化するため、
> Creで切り取られていない残りの断片がリードとしてカウントされる、
> といったことが起こりうるでしょうか。

起こらない理由がわかりませんが、、、切り取られてない箇所でRTPCRしてみればわかるかもしれん。タンパクが発現しないことにより、フィードバックがかかり少し転写産物が多くなっていれば、一部欠いた転写産物でも見劣りしないカウント数になるかもしれない。

RT-qPCRとRNA-seqデータの乖離 削除/引用
No.11206-1 - 2023/02/15 (水) 16:30:48 - mel
いつもこちらで勉強させていただいております。

RT-qPCRとRNA-seqデータの乖離が生じることはよくあることと報告されていますが、
今回、ノックアウトマウスでノックアウトされているはずの遺伝子で、こちらの現象が生じたため、ご質問させていただきました。

今回、Cre-loxPシステムを用い、ある組織のコンディショナルノックアウトマウスを作製し、
単離したその組織におけるqPCRでは、
CT値で30と37程度と、理論的には2の7乗程度、発現が100分の1程度になっているはずなのですが、RNA-seqの結果はほとんど差がありませんでした。
カウント数を見ますと、4000万リード中1000程度でほぼ同等でした。
qPCRのCt値やRNA-seqのカウント数から考えても、
そこまで低発現遺伝子というわけでもなく、またqPCRでは明らかにノックアウトされているのでこの現象に疑問を持っております。

今回のターゲット遺伝子の全身性ノックアウトマウスでは、
臓器は異なりますが、カウントは1/10程度であったので、
RNA-seqのパイプラインによる問題よりも、
Cre-loxPシステムによる影響ではないかと考えております。

例えばCreloxP配列が1つのエクソン領域の両端に入っていたとして、
Creにより切断されると不完全なmRNAとなり翻訳されないところが、
RNA-seqではRNAを断片化するため、
Creで切り取られていない残りの断片がリードとしてカウントされる、
といったことが起こりうるでしょうか。

ただこのような現象が起こりうるとするともっと報告されていそうですが、
そのような報告は見当たりません。

こちらの現象について、suggestionなどあればご指摘いただけますと幸いです。
長文失礼いたしました。

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