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(無題) 削除/引用 No.11199-5 - 2023/02/15 (水) 02:02:32 - おお >[Re:4] tatoさんは書きました : > おお様、2ME様、 > 複数のバンドが出ているだけなら修飾や何らかの分子との結合、二量体形成など考えられるのですが、２つの抗体で違う染色になることがよくわからなかったです。 > 修飾や結合によってそのエピトープがマスクされるのでしょうか？ 抗体の抗原の領域の長さによって可能性は変わってくるだろうけど、糖鎖など複数箇所修飾されることはよくあることだと思いますし、リン酸化もですね。リン酸化と糖鎖両方ついてどちらかの修飾がエピトープと重なって見れないって言うこともあると思いますし。

(無題) 削除/引用 No.11199-4 - 2023/02/14 (火) 19:50:38 - tato おお様、2ME様、 多くのご提案ありがとうございます。 タンパク質の凝集の可能性もあったため、サンプルに尿素を加えることも試してみましたが全く挙動には影響しなかったです。 複数のバンドが出ているだけなら修飾や何らかの分子との結合、二量体形成など考えられるのですが、２つの抗体で違う染色になることがよくわからなかったです。 修飾や結合によってそのエピトープがマスクされるのでしょうか？ 2ME様からのご提案のようにtruncateを作ってみたりtagを付けたりしてもう少しいじってみます。 ありがとうございました。

(無題) 削除/引用 No.11199-3 - 2023/02/14 (火) 08:47:45 - 2ME 生理的な現象かもしれないし、ベクター・発現系・抽出・検出の技術的課題かもしれない。 可能性は低いがエラスチンのようにリジンの共有結合による分子間架橋もありえる。 まずは原因を絞り込むことでしょう。 たとえば、 抗体のepitopeを残したtruncated formを発現させてみる、 目的cDNAなしもコントロールにする、 無細胞系で発現させてみる、 ホストを変えてみる、 タグをつけて抗タグ抗体で見てみる、 endoglycosidaseで脱糖鎖を試みる、 などもありかと。

(無題) 削除/引用 No.11199-2 - 2023/02/14 (火) 04:54:37 - おお タンパク同士がアグっている可能性もありますから、サンプルバッファーを加えたものが残っていましたら飽和尿素を等量くわえて泳動してみてください。 その他の可能性としては何らかのコバレントな修飾が可能性あると思います。分子量が大きく変わるものとして糖鎖修飾などあるでしょうし、場合によってはpolyglycylationや polyglutamylation とか。リン酸化も大きく分子量（見かけ）を変えることもあるにはあります。ユビキチンも可能性としてないとまでは言えません。あまり見られない現象としてはROS等によって近傍のタンパク同士がクロスリンクしてしまうというもので、どこまで可能性があるかはなんとも言えません。 いかのURLではタンパクのコンプレックスが通常のSDSPAGEでも（例外的に）検出される例などが挙げられています。 https://www.scientistlive.com/content/why-does-observed-protein-molecular-weight-differ-calculated-one そのタンパクを発現している細胞や組織でエンドのタンパクを確認できないでしょうか？確認できるならKDしてみるとある意味裏が取れるとも言えるでしょう。

ウェスタンでのN末抗体とC末抗体で大きくバンドが変わる 削除/引用 No.11199-1 - 2023/02/14 (火) 00:36:57 - tato お世話になります。 最近あるタンパク質を293で過剰発現させ(pcDNA系のベクターを使っています）、ウェスタンでの検出を試みています。 このたんぱく質はおよそ22kDaで、２つの抗体（N末とC末の抗体、タグではないです）を使いました。 問題はN末抗体で検出した際には22kDaだけでなく、75kDaにも特異的なバンドが認められました。non-transfectionのサンプルではまったくこれらのバンドは認められません。ところがC末抗体ではこれら２つのバンド以外にもう一つ45kDaにバンドが現れ３つのバンドが認められます。 このウェスタンはside-by-sideで行っておりまして、N末抗体では45kDaには全くバンドが認められません。 ２量体や3量体の可能性もありますが、還元状態でboilしております。 多くのタンパク質でのウェスタンをしておりますが、このような説明のつかない挙動を示しているのはこのたんぱく質のみです。 何か根本的なことを見落としているのではと思っております。 よろしくお願いします。

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