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(無題) 削除/引用 No.11196-5 - 2023/02/15 (水) 06:52:27 - おお その正常うさぎの抗体なんですが、対象の組織のLysatesなどを使って吸収して使ってみる手はないかなと思いました。吸収は色々やり方があるとは思うけど、Lysatesのタンパクをカラムにコバレントに結合させてその抗体を通してつかないものを回収するとか、コームなしのSDSPAGE用ゲルで流して膜にトランスファーしておいて、その膜を抗体溶液につけて吸収するとか、ELISA用プレートにLysateのタンパクを吸着して抗体溶液（この場合染色に使うような溶液を使うといいかも）を入れてしばらくインキュベーションするとか。 市販の正常動物IgGとかどうしてるんでしょうね。吸収とかしてそうな気もしてきている。 くわえて、私は詳しくはないですが抗体反応のブロッキングにゴート血清などを使っておくとFcリセプターは反応しない異種のIgGでブロックされるのでバックが減るんじゃないのかな。もし使ってなかったら。

(無題) 削除/引用 No.11196-4 - 2023/02/14 (火) 18:03:25 - w ウサギは菌体に対する抗体を持ってることはあるよ。免疫するとき、陰性コントロール用にはじめに採取するpre-免疫の血清とかで大腸菌とかのライゼートでウェスタンすると反応したりすることあるし。germ freeとかじゃなくて普通に飼育してるわけだし、別に腸の組織片とかと反応しても不思議ではないけど。

(無題) 削除/引用 No.11196-3 - 2023/02/12 (日) 14:41:01 - おお 使っている抗体のアイソタイプはなんですか？ポリクロなら混合物ですよ。 Fcリセプターなどを介したものであれば新たに買っても同じことが起きると思います。

(無題) 削除/引用 No.11196-2 - 2023/02/12 (日) 14:14:01 - 2ME まず、NRI（正常ウサギ抗血清のproteinA精製品）が染まってしまった件の原因を特定した方がよいでしょう。そうでないと1.と2.のどっちがよいかも、どっちもだめなのかも、なんとも言えません。 書き込み内容を読んで思うことはいろいろあるものの、一次抗体と二次抗体の情報がわからないので絞り込めません。 一次抗体の抗原名は伏せていいので、せめて動物種を書いたほうがよいですよ。ウサギのモノクロですか？それともマウスのモノクロですか？二次抗体は抗ウサギIgG、それとも抗マウスIgG？ というのは、とりあえず一般論を言えば、腸管は免疫系が発達しているので、バックが高めに出るだろうなあ、とは思います。 NRIがマウス腸管の（何かの細胞の）FcγRにくっついたとか、二次抗体がマウス腸管由来のIgGかなんかに反応しちゃったとか、NRIの精製度が低くて変な物が入っているとか、、、疑い出せば切りがない。 まあ、そんなことはさておき、思い切ってアイソタイプコントロールを買って、とりあえずコントロールとして使えるかどうかを試してみる、という考え方もあります。金と時間の無駄になるかもしれないが。そういう意味では1.です。

免疫組織染色時のアイソタイプコントロール抗体について 削除/引用 No.11196-1 - 2023/02/12 (日) 11:53:21 - IHC いつも勉強させてもらっています。 これまでに蛍光免疫組織染色時には、一次抗体を加えないものをコントロールとしておいていましたが、アイソタイプIgGをコントロールに置くようにと指摘があり、そのようにしています。 ただ、新たにアイソタイプIgG抗体を買うことができなかったので、正常ウサギ血清をラボで発見し、それをProtein Aカラムで精製したものをコントロールとして使用できないかと考えました。 きちんと精製はでき、マウス腸管の蛍光免疫組織染色をしたところ、そのコントロール抗体でもしっかり染まってしまいました。 このことから、可能性として 1. アイソタイプIgG抗体をやはり買うべき 2. 正常ウサギ血清由来のIgGでもコントロールとして適していて、けれども蛍光免疫組織染色のブロッキングなどの操作が不完全なため、アイソタイプIgG抗体をたとえ購入しても染まってしまうはず。なのでプロトコルの改善をすべき が考えられます。 どちらがそれらしいでしょうか？ ちなみに対照としてゴルジ体が染まる抗体を一次抗体（ウサギポリクロ）を使用した場合、ゴルジしか染まっていませんので、２の可能性は低いのかなと思っています。 節約のためにウサギ血清由来IgGをコントロールとして用いたかった背景があります。 ご意見いただけましたら幸いです。

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