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(無題) 削除/引用 No.11190-18 - 2023/02/17 (金) 15:15:13 - ema 機械をもっている所があればJessとかWes　2-40 kDaプレートを使う、というのは。

(無題) 削除/引用 No.11190-17 - 2023/02/12 (日) 02:11:13 - おお >[Re:16] G25さんは書きました : > RIでサンガーシークエンスしてたころ、バカでかくて厚さが0.4 mmくらいのシークエンスゲルをつくるとき、 > ゲル板に注入している途中で固まらないように、予めアクリルアミド液を氷浴で冷してやってたけどねえ。 > SDS-PAGはできないのかな。SDSの濃度は冷やしても析出するほどではなさそうだけど。 SDS は(多分)大丈夫です。私はゲルにsdsを入れませんので その心配すらありません。脱気をしているので泡ぶくが出るのを嫌ってます。泳動バッファーから供給されるSDSで十分と考えられてるようでプレキャストゲルにはSDSが入っていないものもあるようです。 それで、冷やすのはグラディエントゲルを作る時にやることがあります。

(無題) 削除/引用 No.11190-16 - 2023/02/11 (土) 19:28:30 - G25 RIでサンガーシークエンスしてたころ、バカでかくて厚さが0.4 mmくらいのシークエンスゲルをつくるとき、 ゲル板に注入している途中で固まらないように、予めアクリルアミド液を氷浴で冷してやってたけどねえ。 SDS-PAGはできないのかな。SDSの濃度は冷やしても析出するほどではなさそうだけど。 あと、最初に書いたように、特に難しい分離をしたいならプレキャストゲルにするのが早道だったりする。おねだり、

(無題) 削除/引用 No.11190-15 - 2023/02/11 (土) 18:57:39 - 4 具体的な蛋白質名を教えていただければ。

(無題) 削除/引用 No.11190-14 - 2023/02/11 (土) 10:56:11 - toto > 15%のゲルを使ってみたのですが、固まるのが速く気泡が入ってしまいゲルに偏りが生まれてしまったようでまた失敗してしまいました。15%くらいの濃度の高いゲルを作るコツをどなたか教えていただけませんでしょうか。 APSとTEMEDの量が多すぎるのだろうと思います。うちでは50mLのビーカーに10mLのアクリルアミドとトリスHCl溶液を入れて、10%APSを90uL、TEMEDを9uL加えてさっと静かに流し込んでます。

(無題) 削除/引用 No.11190-12 - 2023/02/11 (土) 08:34:54 - おお >[Re:11] iさんは書きました : > 皆さん本当にありがとうございます。 > 15%のゲルを使ってみたのですが、固まるのが速く気泡が入ってしまいゲルに偏りが生まれてしまったようでまた失敗してしまいました。15%くらいの濃度の高いゲルを作るコツをどなたか教えていただけませんでしょうか。何度も申し訳ありません。 APSを少し下げてみてください。 あるいはAPS、TEMEDを入れる前は氷上とかで冷やしておいて重合速度を落とす。 重合する際の発熱で泡が出ているのでしょうかねぇ。それなら重合する前に脱気しておくといくらか防げると思いますが、脱気のため重合速度が早くなるので、脱気してないときと同じ感覚でAPS加えるとゲル板に注ごうとしたとき重合が始まってしまっていることもある。 ２０kDaなら１２％でもどうにかなるけど。１０と２０の間なら１３.５％。ちなみにTris-glycineの系ならゲルのTris-HCl (pH8.8)の濃度を少し高めに（５００ー６００mM）設定すると解像度が上がることがあります。ちょっとレーンの高分子側で膨らんだりすることもありますが。

(無題) 削除/引用 No.11190-11 - 2023/02/11 (土) 08:03:06 - i 皆さん本当にありがとうございます。 15%のゲルを使ってみたのですが、固まるのが速く気泡が入ってしまいゲルに偏りが生まれてしまったようでまた失敗してしまいました。15%くらいの濃度の高いゲルを作るコツをどなたか教えていただけませんでしょうか。何度も申し訳ありません。

(無題) 削除/引用 No.11190-10 - 2023/02/10 (金) 17:33:25 - T-2 PVDF膜を使っているならImmobilon-Pよりポアサイズが小さい Immobilon-Psqを使うとか。 比較したことがありますがセミドライで少し強めに転写すると ろ紙側まで抜けるタンパクが減り確かに低分子量の転写がよくなりました。

(無題) 削除/引用 No.11190-9 - 2023/02/10 (金) 15:54:44 - toto 分子量8000〜12000くらいの超マイナー蛋白の検出を15％ゲルからsemidryでこのところ長くやってますが、やり方はJan Kyhse-Andersen の原報とほぼ同じで、違いはImmobilon-Pと、ATTOのぶ厚いblot用の濾紙を上下それぞれ3枚でやってること、あと原報の透析膜は使ってないことくらいです。横長ミニスラブで、125mA1時間で転写してます。

(無題) 削除/引用 No.11190-8 - 2023/02/10 (金) 15:24:26 - G25 そうね、 低分子量に標的を絞るなら、高分子量は犠牲にしてでもSDSなし、MeOH高めがいいでしょう。ゲルにも含まれているSDSかなり影響するので、転写バッファーでよく洗って除いておくといい。

(無題) 削除/引用 No.11190-7 - 2023/02/10 (金) 13:52:12 - 774R メンブレンから抜けやすいタンパク質は、トランスファーバッファーをSDS抜きとか、メタノール多めにすると改善する場合があります。 PVDFとニトロセルロースのどちらが良いかはケースバイケース。 出来れば、トリス-トリシンバッファーの系で泳動した方が低分子の解像度が良いのでバンドがシャープになって検出感度も上がる。

(無題) 削除/引用 No.11190-6 - 2023/02/10 (金) 13:10:31 - i 皆さんありがとうございます。 セミドライ式でやっています。 皆さんにいただいたアドバイスを活かしてまた挑戦してみます。

(無題) 削除/引用 No.11190-5 - 2023/02/10 (金) 12:30:27 - G25 転写はタンクですかセミドライですか。 タンクだと（セミドライもそうかも知れないけど）転写バッファによって転写効率やスッポ抜けの程度が異なるので（両者はある程度トレードオフ）、その変異工夫のしようがある。 低分子量のスっぽ抜けはPVDFのほうが起こりにくいと思う（今どきNC使っている人はあまりいないと思うけど）。かつては低分子量の吸着性を高めたと称するPVDF膜が売られていたりした。しかし、最近見かけないので、そういう差別化が意味ないほど通常のPVDF膜の性能が良くなっているのじゃないかと思う。 メンブレンの上にゲルを乗せようとすると（ということはセミドライか？）、気泡を入れないように操作するのが難しくなる。 ゲルの上にメンブレンを乗せるようにする。タンクブロットなら最初からそういう順で重ねていけばOK。セミドライなら、バットの上でろ紙、ゲル、メンブレン、ろ紙の順で重ねて、電極に乗せるときにひっくり返す。

(無題) 削除/引用 No.11190-4 - 2023/02/10 (金) 02:40:48 - おお どのようにうまく行かないのか、、、 ２０kDaより小さいタンパクはTransferのコンディションによってはすり抜けてしまうこともあります。むかし大きいタンパクも比較的しっかりとトランスファーされるので昔からあるWetの装置で２０Vぐらいでオーバーナイトでやってたころ、ある１０kDa強のタンパクがなかなか検出されなかったのでどうしたもんかと思った事があります。 ６０分のトランスファーにするとより良く検出されたりもしますが、とりあえずニトロセルロース膜を使ってたのでPVDFに変更すれば検出が安定しました。 また。０.４ミクロンの膜が一般のプロトコールでは推奨されていますが、０.２（０.２２？）ミクロンの膜のほうが吸着力が高いので私は普段からそちらを使っています。ペプチドとかになると０.１ミクロンのニトロセルロースとか使っているのを見たこともあります。 泡についてはこんなやつ見たことないでしょうか？ https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/84747 あるいは円筒状のようなものがあれば代用できます。あぶないのでおすすめしませんが、大昔はserological pipette（１０mlとか）を折って使いやすい長さにしたりして使ったりも。ペン類でも膨らみがない円筒状なら使えるでしょう。 バッファーについては理想的には脱気するなどすればトランスファー時に生じる泡は回避できる可能性が高いです（やってはないですけどTransfer bufferを入れた容器ごと超音波洗浄槽にいれたりすると脱気はできます）。よく冷やしてから使うようにしてますが、冷やすと紛れた泡は解消されます。ただし、泳動中に温度が上がってくると泡が出てくることはあります。個人的にはたまに小さな泡がポツポツと見れるくらいかなというぐらいです。ま、やっぱり脱気したほうがいいのかもしれません。

(無題) 削除/引用 No.11190-3 - 2023/02/09 (木) 21:45:29 - G25 tricine SDS-PAGEとか。 tricine系に限らず、難しくデリケートなタンパク質ゲル電気泳動は、自作ゲル(QCが行き届かず、性能や再現性が劣る)じゃなくて、コストがかかっても市販のプレキャストゲルえお使うのが吉。

ウエスタンブロットについて 削除/引用 No.11190-1 - 2023/02/09 (木) 20:28:55 - i お世話になります。 20kDa以下のサイズのタンパク質をウエスタンブロットで検出したいのですが、うまくいきません。 皆さんがウエスタンブロットをするときに気をつけていらっしゃることなど、ウエスタンブロットのコツを教えていただけませんでしょうか。また、泳動したゲルをメンブレンにのせるときにどのように泡を抜くのが一番いいのかについても悩んでいます。この点に関しても教えていただけると嬉しいです。 よろしくお願いいたします。

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