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(無題) 削除/引用 No.11187-20 - 2023/04/16 (日) 22:26:03 - Skeptics ここも最初のG25さんの回答ですっきり解決しているのにトピ主さんが反応していないものだから同じことを繰り返したり話が逸れたり。質問する方は切実に解決を求めているのではないのですか？

(無題) 削除/引用 No.11187-19 - 2023/04/15 (土) 16:17:09 - oyaji 電気泳動して、量を推定するですね。バンドがしっかりしていれば、大概大丈夫。 シークエンスは、通常、PCRでやるはず。（つまりそれほどの正確性、量は不要） カラムはRNAに親和性が高い。（プラスミドがカラムを通過するだけ、、、） ナノドロップ系は不正確。通常のミニプレップ後は測定不能なはず。 本当にしっかりやるなら、マキシプレップして、吸光度して、ゲル流す。

(無題) 削除/引用 No.11187-18 - 2023/02/11 (土) 18:00:26 - G25 >[Re:16] えさんは書きました : > すみません、ちょっと驚いています。 > > 私はトピ主と同様のサンプル（RNA混入あり）を受託でシークエンス解析しています。 > カラムが必要だとは。向こうでカラム精製しているのかもしれませんね。。 > > ただ、みなさんもカラム精製を基本にシークエンスしているのでしょうか？ > 文脈からだとRNAse入りP1でもPEG沈では不完全というようにも読み取れます。 そんな話は全然出てきていないと思うけど。 質問者さんの「シークエンス用のプラスミドを精製したけど吸光度がプラスミド量に乖離があってうまくいかない」という質問に対して、それはRNAが混入しているからだからと回答が付いている。 解決策として、ひとつは電気泳動像でバンド強度で見積もるようにする。もし吸光度で測るならRNA（の分解物）を除く処理（シリカカラムだったりPEG ppt）が必要だというはなし。RNase処理だけでは不十分だとは言っているがPEG pptでは不完全という話は出ていない（RNaseで分解しておかないとPEG pptは効かないという話はでた）。 サイクルシークエンスで　RNAやRNA分解物の除去は必須でないことは、No.11187-7で言及した。

(無題) 削除/引用 No.11187-17 - 2023/02/11 (土) 16:39:03 - おお 元々の質問はシーケンスというよりは、DNA量が測れてなさそうですということなので、測るためには正攻法としてRNAを極力除く、あるいはそのまま電気泳動で量を見積もるという回答がついたのだと思います。シーケンスに限ってはRNAの混入はそんなにクリティカルではないのですが、DNA量 を測るために必要な事について必要な知識がない場合、シーケンス以外の目的でDNAの正確な測定ができず、実験にならない事もあるだろうし、方法論をまずは把握しておくべきとおもったしだいです。

(無題) 削除/引用 No.11187-16 - 2023/02/11 (土) 15:51:57 - え すみません、ちょっと驚いています。 私はトピ主と同様のサンプル（RNA混入あり）を受託でシークエンス解析しています。 カラムが必要だとは。向こうでカラム精製しているのかもしれませんね。。 ただ、みなさんもカラム精製を基本にシークエンスしているのでしょうか？ 文脈からだとRNAse入りP1でもPEG沈では不完全というようにも読み取れます。 私が学部生の時はPEG沈させたものを自分のラボのシークエンサーで配列決定していました。

(無題) 削除/引用 No.11187-15 - 2023/02/09 (木) 14:58:38 - noname 浅学が露見してしまいました。 普段、シリカカラムしか使っていないと忘れてしまいますね。 Nanodropの測定でコントロールしたいのであれば、シリカカラムで精製が 余計な心配をしなくてよいかも。。。？

(無題) 削除/引用 No.11187-14 - 2023/02/09 (木) 14:41:15 - G25 PEG pptで除去できるのはオリゴヌクレオチドやモノヌクレオチド。 PCR後のprimer, dNTP除去なんかにも使えます（シークエンスのための前処理なんかで）。 RNAはRNaseで小さく断片化しなければ除去できません。 フェノールクロロフォルム抽出やアルコール沈殿ではRNA分解物は除去できません。オリゴヌクレオチドの精製や回収にもフェノールクロロフォルム抽出やアルコール沈殿は使われます。 いわゆるP1にRNaseをいれてもそれだけではRNA断片は残ります。 その後、シリカカラムによる精製をすることでRNA断片が除去されます。 繰り返しますが、断片化してEtBr染色等で見えなくなっても、核酸に典型的な吸光性はあります。

(無題) 削除/引用 No.11187-13 - 2023/02/09 (木) 14:24:15 - G25 >1 ng/ulと出ました。 文脈を見ると 「1 ug/uLと出ました。」の間違いみたいですが、 10 uLのせてようやく見えるくらいの濃度だったら1 ng/ulくらいと推定され、TSさん、おおさんの指摘の通り、収量がせいぜい100 ngぽっちしかないことになりますね。 だとしたら、 >1 ng/ulと出ました。 が本当で、「総量100 ugのプラスミドが採れた」とか「1 ug (= 1 ul) 分乗せても全くバンドは見えず、10 ug (= 10 ul) 分乗せると」のugというほうが勘違いか？ ちなみに、高コピー数のプラスミド(pUC, pBlueScriptなど）なら1 mL LBの終夜培養液でおおよそ2~3 ug、幅を広くみても1~5 ugは取れるはず。 低コピー数（pBRなど）はその1/10くらい。1 mL培養液で収量100 ngはいい線。

(無題) 削除/引用 No.11187-12 - 2023/02/09 (木) 14:19:44 - おお >[Re:9] nonameさんは書きました : > RNAの除去はPEG沈か、RNaseA処理後フェノクロ、エタ沈でしょうかね。 > > 今後やるとき、P1にRNaseAを入れておくとRNAの混入は抑えられるとおもいます。 多分入っていたんだと思う。全く使ってなかったらエチブロでプラスミドより数十倍の強いシグナルが見えてしまうから。RNaseを入れていても、ぼやーっとバンドが出る事もあるし。なのでRNaseA処理後フェノクロ、エタ沈が有効とまでは言い難い。エチブロいがいの色素で、そういう RNAが全く見えないものがあり、つかっているなら話は別。 PEGはRNAも沈殿するので消化されてないRNAだと余り有効とは言えない。除けるのはオリゴ。だからさいしょにRNaseを使ってないなら、PEGの前に消化する方が効率的に除ける。

(無題) 削除/引用 No.11187-11 - 2023/02/09 (木) 13:59:13 - momo すみません、G25さんのことを呼び捨てにしてしまっていました。

(無題) 削除/引用 No.11187-10 - 2023/02/09 (木) 13:58:13 - momo G25が既にお書きになっているように、RNaseAで消化後の短いRNAやヌクレオチドは通常のエタノール沈殿では除けませんよ。アガロースゲルに流してEtBrなんかで染色してもそのあたりには何も見えないかもしれませんが、ODにはがっつり引っかかってきます。

(無題) 削除/引用 No.11187-9 - 2023/02/09 (木) 13:21:41 - noname RNAの除去はPEG沈か、RNaseA処理後フェノクロ、エタ沈でしょうかね。 今後やるとき、P1にRNaseAを入れておくとRNAの混入は抑えられるとおもいます。

(無題) 削除/引用 No.11187-8 - 2023/02/09 (木) 12:55:50 - おお > 10 ug (= 10 ul) 分乗せるとようやく辛うじて見えました。 エチブロでかろうじて見れるレベルなら検出感度から見積もって10ulで5から10ng。収量は100ngあるかわからないレベルですね。少ないです。 ローコピーナンバーのプラスミドなんだろうか、、、

(無題) 削除/引用 No.11187-7 - 2023/02/09 (木) 12:35:07 - G25 ちなみにABIのサイクルシークエンスではプラスミドからRNAを除去する必要は、RNase処理も含め特にありません（たしかABIのマニュアルでは超遠心やPEG pptで除去すべしと書いていた。今もそうかどうかはしらないけど）。 KlenowとRIでサンガーシークエンスしていたときは、RNaseとPEG pptによるRNA/RNA分解物の除去は必須だったけど。

(無題) 削除/引用 No.11187-6 - 2023/02/09 (木) 12:29:50 - TS >1 ng/ulと出ました。 詳細は別で議論するとして、 100マイクロリットルに溶解して1ナノグラム/マイクロリットルになったのだから、１ミリリットルの大腸菌から、100ナノグラムのプラスミドが取れたんじゃないの？ １マイクロリットル＝１ナノグラム・・・見えない 10マイクロリットル＝10ナノグラム・・・どうにか見える 読み違いでしょうか。

(無題) 削除/引用 No.11187-5 - 2023/02/09 (木) 12:15:49 - G25 シークエンス用のプラスミドならまさに、泳動で見積もるくらいで十分。 そんなにきっちり量をあわせなければならないものじゃないので。 うちでシークエンスを外注しているところでは、吸光度ではなく泳動像で濃度を見積もることを推奨しているくらいです（それこそnanodropで測って実際よりも濃度の低すぎるサンプルが送られてくるトラブルがあるらしい)。 倍くらいの誤差は大丈夫（多いほうよりも少ないほうに違っているほうが失敗がない）。多少、濃度が違っていても濃度合わせに神経質にならなくてもいいです。ルーチンにこれくらいの濃度で取れるというのがわかっていれば、それに合わせておいて、泳動でチェックして極端に外れていないかだけ確認すればよし。多少、外れていても、いちいち個別に濃度調整をする必要はありません。それをやったら多検体のときなんか大変です（大変なのに特に結果が向上するわけじゃない）。

(無題) 削除/引用 No.11187-4 - 2023/02/09 (木) 10:59:00 - おお RNAが混入しているのでしょう。PEG沈でかなりのぞけると思います。念のためにRNase A処理してからPEG沈でもいいかもしれません。まあPCR Purification kitなどのカラムでもいいかもしれませんがそれなら最初からキットに、、、って話。 DNA量の測定であればシーケンス用ということなのできっちりな量でなくても良さそうなので、電気泳動してマーカーと蛍光強度を比較してマーカーの重量からあなたのDNAを見積もるぐらいでもいいでしょう。見た目同じくらいのシグナルでそのバンドの重量と一緒ということ。

(無題) 削除/引用 No.11187-3 - 2023/02/09 (木) 10:49:13 - G25 RNA由来。 RNaseで分解してEtBrなどで染まらなくなっても、分解産物のモノヌクレオチド、オリゴヌクレオチドはEtOH pptで落ちてきますし吸光があります。 シリカカラム精製では除けます。 PEG pptでも除けます。 ラフなプラスミド精製では、定量は吸光度よりゲル電気泳動を染色して肉眼の比色で見積もる程度の精度で十分なことが多いし、むしろ正確だったりします。どうせ泳動でチェックするのなら、吸光度なんかスキップして、バンドの比色で見積もるだけで良いと思います。特に多サンプル処理のとき。

ミニプレップしたプラスミドが正確に測れない原因 削除/引用 No.11187-1 - 2023/02/09 (木) 10:25:28 - nanodrop いつも拝見しています。 プラスミドを1 mlの大腸菌が培養されたLB液からP1, P2, P3で処理し、エタチンをしています。 エタチン後のペレットは見えているのですが、それを100 ulのTEで溶解し、nanodropで測定すると、 1 ng/ulと出ました。 つまり、1 mlの大腸菌培養液から総量100 ugのプラスミドが採れたことになり、そんなばかなと思っています。実際、電気泳動すると、1 ug (= 1 ul) 分乗せても全くバンドは見えず、10 ug (= 10 ul) 分乗せるとようやく辛うじて見えました。 一方、midiprepで調製したプラスミドを1 ug/ulにしたものをnanodropで測定すると、正しく1 ug/ulと出ましたし、電気泳動で1 ug分流すとがっつりバンドが出ました。 以上のことを踏まえますと、 P1~P3してエタチン後にTEに溶解したサンプルでは正しくnanodropで測定できないのでは？と考えました。 とすると、DNA sequencingで500 ngを送る必要がある場合、どのように濃度測定すればよいのかわかりません。アドバイスいただけると助かります。 稚拙な質問で恐縮です・・・

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