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(無題) 削除/引用 No.11173-9 - 2023/02/07 (火) 16:24:31 - G25 transfection-readyの精製をしたが濃度が不足なので濃縮したいという話だと読んだ。

(無題) 削除/引用 No.11173-8 - 2023/02/07 (火) 14:22:52 - おお >[Re:7] 774Rさんは書きました : > >キット（シリカやDEAEなどつかったもの）でもそうなんでしょうか？ > フラグメント化したような短い核酸（RNA）を除くならPEGの方がいいかもしれません。 > > キットはRNAのコンタミは少ないですね。 > 古典的なエタ沈・イソプロ沈を行う方法を通常のミニプレップと表現しました。 > 質問者も詳しく書いてくれてないので、実際どうなのかは不明。 ありがとうございます。感触的に、古典的(キットでを使わない)方法を知っているなら、エタチンの類は基本的操作になるので、なんとなくキットでで済ましてるのかなと思ってました。

(無題) 削除/引用 No.11173-7 - 2023/02/07 (火) 14:06:10 - 774R >キット（シリカやDEAEなどつかったもの）でもそうなんでしょうか？ フラグメント化したような短い核酸（RNA）を除くならPEGの方がいいかもしれません。 キットはRNAのコンタミは少ないですね。 古典的なエタ沈・イソプロ沈を行う方法を通常のミニプレップと表現しました。 質問者も詳しく書いてくれてないので、実際どうなのかは不明。

(無題) 削除/引用 No.11173-6 - 2023/02/07 (火) 05:43:07 - おお >[Re:5] 774Rさんは書きました : > 通常のミニプレップ後のプラスミドだとすると、分解しきらないRNA断片が一緒に落ちてきてる可能性があります。 キット（シリカやDEAEなどつかったもの）でもそうなんでしょうか？ フラグメント化したような短い核酸（RNA）を除くならPEGの方がいいかもしれません。

(無題) 削除/引用 No.11173-5 - 2023/02/06 (月) 16:03:02 - 774R 通常のミニプレップ後のプラスミドだとすると、分解しきらないRNA断片が一緒に落ちてきてる可能性があります。 夾雑した短いRNA断片が保存中に分解され、2回目のエタ沈では共沈せず、想定より薄くなる可能性があります。 再懸濁は余裕をもって濃いめになる液量で行った方が良いです。

(無題) 削除/引用 No.11173-4 - 2023/02/06 (月) 15:09:46 - おお >200 ulのTEに対して、100% ethanolを加えて室温10分待って、 NaClなら終濃度で~200mM加えて、エタノールを加えてください。イソプロパノールでも大丈夫です。単なる濃縮において余り両者で違いを感じません。酢酸ナトリウムなら300mM。

(無題) 削除/引用 No.11173-3 - 2023/02/06 (月) 13:36:41 - G25 スタンダードなDNA用のエタノール沈殿で（が）いいと思いますけど。 つまり、 1/10 vol (20 uL)の3 M NaOAc (pH 4.8-5.2)を加え、2 vol (400 uL）のEtOHを加えて遠心。沈殿を70% EtOHでリンスして自然乾燥。 もちろんIPA沈殿でもいいです。この場合、加えるIPAは0.5~1 vol。 IPAのメリットはvolを小さく抑えることができること。 一方で夾雑物（塩）が共沈しやすいとも言われます。 塩は外にNaCl, LiCl, NH4OAcなどのオプション（それぞれworking concは異なる）がありますが、NaOAcが一番クセがないので第一選択。 ちなみにストック溶液を自作するなら、終濃度3 Mになる量のNaOAcに終体積より少なめの水で解かしてHAcでpHを下げてから、水を加えて体積をあわせオートクレーブ（HAcを入れない中性付近のNaOAcでも沈殿しないことはない）。 回収率も確実性も高い方法ですが、なれていない人はDNAをロスしやすい。 遠心時間を長めに、上清を除くときは慎重に（自身のないときは再回収に備えて上清は捨てずに取っておくといいでしょう）、必要なら70%& EtOHを入れたあと再遠心。DNAの沈殿は底に固まっているんじゃなく、遠心端側の壁に広がってくっついているので、体積を減らして再溶解する場合は、 壁の上の方、アルコールを加えたときの水面付近まで溶媒が舐めるようにする。

(無題) 削除/引用 No.11173-2 - 2023/02/06 (月) 12:16:10 - AA なにかしらの塩の溶液を入れないと沈殿しないと思いますので、書かれた手順だと沈殿しないと思いますが、基本的には ＞エタノール沈殿操作後に小さめの容量で溶出し、分光光度計で濃度を測定後に1mg/mlに調整する という認識で良いのではないかと思います。 個人的にはせっかくプラスミドなのだから大腸菌操作をして増やしたらいいのにとは思います。施設や装置の制限などからできないのかもしれませんが。

Plasmidの濃縮について 削除/引用 No.11173-1 - 2023/02/06 (月) 11:47:54 - Okas 大変初歩的な質問でごめんなさい。 0.6 mg/mlほどの濃度のmidi-prep後のプラスミドがTEに溶けた状態で200 ulあります。 これを1 mg/mlに再調製したいです。 特殊なtransfectionに使用する予定で、どうしても1 mg/mlにする必要があります。 どういう濃縮方がおすすめでしょうか？ 200 ulのTEに対して、100% ethanolを加えて室温10分待って、その後、15000 rpm, 10 min遠心後、70% ethanolでペレットを洗浄したのに、50 ulのTEで溶解してnano dropして最終的に1 mg/mlに調整できますでしょうか？ それともPEG沈やイソプロ沈の方がいいでしょうか？ 濃縮実験はしたことがなく、初歩的な質問で恐縮ですが、どうか教えてください。 よろしくお願いします。

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