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(無題) 削除/引用 No.11169-9 - 2023/02/05 (日) 06:52:10 - おお >使っている逆転写酵素は10pgから1ugのtotal RNAを許容していて、500ng/ulのRNAを用いて逆転写反応をさせるときのRNA総量は上限の1ugにしています。 要するに上限の１ugの場合、500ng/ulのTotal RNAを２ul とって１ugを逆転写の反応に用いたということですね。そしてその一部をとってqPCRに回したということでしょうか。それとも１スッテプのキットとか使っているのでしょうか。後者ならあまり細かくデーターを見たことがないのでよくわかりませんけど、前者なら方法論的には大丈夫そうでもやはりちょっとGAPDHCでt13-15は少なすぎるような気がします。 ま、他の経験のある人のコメントも待ちましょうか。

(無題) 削除/引用 No.11169-8 - 2023/02/05 (日) 01:48:55 - 融子 使っている逆転写酵素は10pgから1ugのtotal RNAを許容していて、500ng/ulのRNAを用いて逆転写反応をさせるときのRNA総量は上限の1ugにしています。GapdhのCt低値の理由にCMVプロモーターは関係なく、テンプレートに含まれるGapdh RNA（cDNA）量で決まるだと思いますので、逆転写の際のRNA量を上限いっぱいにしてからqPCRをかけると濃すぎるのかも、ということですね。 逆転写なしのCTRLはとっていなかったです。

(無題) 削除/引用 No.11169-7 - 2023/02/04 (土) 16:13:47 - おお >[Re:4] 融子さんは書きました : > Gapdh は同じサンプル（マウス臓器です）で臓器にもよりますがCt13-15くらいです。cDNAは500ng/ulのtotal RNAから逆転写しています。コンタミチェックはNTCで水をテンプレートにしていて増幅はないです。アガロース電気泳動のレベルでは違いが見えませんでした。テンプレートを薄くすれば解決する、というのはコンタミの影響が見えなくなるから、ということでしょうか。 > > もNTCで32サイクルくらいから怪しい増幅が見えることがあるのでサイクル数を減らして見えないうちに終わらせたりしていました。 500ng/ulのtotal RNAと言うことは例えば20ulのRTの系で10ugのRNAを使っていると言うことでしょうか。多すぎると思います。あまりにも多いと変な増幅も起こりやすくなります。一度お使いの試薬やキットで標準的なりょうを確認ください。superscript では20ulで上限5ugですが、RT -qPCRのプロトコールではさらに一桁ぐらい低い量が標準プロトコールになっていると思います。 また、コンタミの影響が見えなくなるかは、コンタミのしたコピー数に依存するわけでそれが一定量だとわかるすべがないわけだし(-RTをとるとわからなくもないが)、それが変動してある時には高い値が出たり、またある時には低い値が出る事もあるのだからコンタミしないと言うのがあるべき姿(方法)だと思う。 >目的遺伝子のCtが低すぎるのはプロモーターがCMVやCAG GAPDHが低すぎる理由にはなっていません。

(無題) 削除/引用 No.11169-6 - 2023/02/04 (土) 14:57:50 - G25 細胞培養段階や核酸調製の段階でのコンタミネーションの可能性は否定できませんね。 ところで、逆転写なし(RT-)のコントロールは取ってないのですか？ RNA精製でDNAを完璧に除去するのは困難ですから、AAVベクターのDNAからのPCR増幅もコミになってていると思うんですけど。ウイルスなしの対象群がウイルスで汚染してるとか？

(無題) 削除/引用 No.11169-5 - 2023/02/04 (土) 12:17:25 - 融子 目的遺伝子のCtが低すぎるのはプロモーターがCMVやCAG（プロモーターの種類を複数試している状況）というのもあるかもしれません。追記でした。

(無題) 削除/引用 No.11169-4 - 2023/02/04 (土) 12:16:01 - 融子 Gapdh は同じサンプル（マウス臓器です）で臓器にもよりますがCt13-15くらいです。cDNAは500ng/ulのtotal RNAから逆転写しています。コンタミチェックはNTCで水をテンプレートにしていて増幅はないです。アガロース電気泳動のレベルでは違いが見えませんでした。テンプレートを薄くすれば解決する、というのはコンタミの影響が見えなくなるから、ということでしょうか。 コンタミの予防は小分けにした水を使って毎回使い切りにしている、NTCを用意している、PCRのサイクラの部屋がサンプル調製の部屋とは別、くらいしかされていないです。ウイルスのタイトレーションを行うときもNTCで32サイクルくらいから怪しい増幅が見えることがあるのでサイクル数を減らして見えないうちに終わらせたりしていました。

(無題) 削除/引用 No.11169-3 - 2023/02/04 (土) 11:46:32 - G25 コンタミネーション。 日頃からそのベクターやそれを導入した細胞、それをターゲットにしたPCRなんかをやっている実験室環境では、標的となる核酸を大量に扱っているわけですから汚染のリスクは高い。、かなり厳密にコンタミネーション対策をしてもPCRがかかるようなコンタミネーションは起こり得ます。 コンタミネーション対策はたとえば、PCR反応液を調製する部屋と密閉されていない汚染源を扱う部屋を分けるとかクリンベンチで作業するとか、dUTPとウラシルDNAグリコシラーゼの系で運用するとか。

(無題) 削除/引用 No.11169-2 - 2023/02/04 (土) 10:42:25 - おお 解釈に困っているということは、コンタミネーションは否定できているということでしょうか。 ＞Ct 14-15 感覚としてこれは低すぎないかという気がします。Internalコントロールで使うような非常によく発現しているものでも（GAPDHとか）でも標準的プロトコールで２０かそれを超えるところかなと思うので、それよりも３０倍から１００倍みたいな。ちなみのGAPDHも同じサンプルで見てます？また、どれくらいの量のRNAを使ったのか示せますでしょうか？量が多いようなら。減らすことで解決すればいいのですが。。。 実際のPCR産物は電気泳動で流してますか？まあサイズが小さいのでアガロースゲルで別物とかサイズの違いで見るのはちょっと難しいけど、PAGEなら判別しやすいはず。

qPCRの陰性対照で目的産物と同じ融解曲線が出る 削除/引用 No.11169-1 - 2023/02/04 (土) 09:39:44 - 融子 本来マウス生体には発現していない外来遺伝子をAAVベクターに組み込んでマウスに投与し、採材後にその遺伝子発現を調べています。陰性対照としてAAVベクターを処置していない群を設けて処置群と一緒にqPCRにかけ、外来遺伝子がどのくらい誘導されているかを確認したところ、理屈の上では発現していないはずの陰性対照群でも目的遺伝子の発現を示す増幅が見られました。遺伝子を導入した群でCt 14-15くらい、陰性対照群でCt30くらいでした。検出にSYBRを使っているので融解曲線をみると、遺伝子導入群と無処置群で単一かつ同一の位置にピークを認めました。ホモロジー検索をしてもその外来遺伝子と配列が似ている遺伝子はみつからず、PCRのプライマーの特異性評価でも類似配列は引っかかってきませんでした。このようなことはよく起こりうるのでしょうか？試しに別の外来遺伝子でも試してみましたが同じような現象が起こり、どう解釈したらいいのかなと思っています。

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