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(無題) 削除/引用 No.11159-20 - 2023/02/21 (火) 11:02:38 - おお >ほんとは検出で使う抗体のエピトープ部分が共通のネガティブコントロールになるタンパク質があればいいのですが、 RNase +とRNase -で溶出すると違う意味ではありますけど一応対照実験がおけるので図として示しやすいかもしれませんね。

(無題) 削除/引用 No.11159-19 - 2023/02/21 (火) 05:27:42 - おお WBをメインにしたいなら。 ランダムな配列NNN...にビオチンがついているようなオリゴRNAをストレプトアビジンビーズにつけてタンパク質をプルダウンする方法もありかと思います。ただしRNAは非常に強い負電荷を持っているのでイオンクロマトのように非特異的な電荷による相互作用を引き起こす可能性があります。終始ヘパリン（負電荷がつよく蛋白の正電荷の部分を中和してくれる）かスペルミジン（正電荷を持っていて核酸の負電荷を中和してくれる）、場合によってはDNAやtRNAなどを加えておいて非特異的な相互作用を抑えるようにしたほうがいいでしょう。特異的な相互作用があればこのような電荷だけの相互作用に打ち勝って結合するものと思います。塩濃度も上げれるだけ上げておいたほうが電荷による相互作用が減ります。 プルダウン後はそのままサンプルバッファーをいれてWBしてもいいですが、それよりもRNaseをくわえてRNAを壊すことでタンパクをビーズから外したほうがRNAとの相互作用が明確になります。ほんとは検出で使う抗体のエピトープ部分が共通のネガティブコントロールになるタンパク質があればいいのですが、その辺は無理かもしれませんね（なにかタグがついていたら、そのタグに関係ないタンパクがついているものとか）。かわりにオリゴなしのビーズでつかないことを示してネガコンにするとか、そのタンパクのリコンビナントが熱変性とかできるなら変性で結合活性がないということでネガコン的な役割をしてもらうかでしょうね。 またこの方法だとうまくいくとビーズからタンパク溶出後SDSPAGEしてCBBで染色することができるでしょう。その場合はBSAをネガティブコントロールにしてBSAはCBBで染色されないことを示せばいいです。

(無題) 削除/引用 No.11159-18 - 2023/02/20 (月) 13:24:32 - 654 御助言ありがとうございます。 今調べてみたら、近年Sybr greenベースで、転写不要のgel shift assayもあるようですね。検出感度はどうなのか分かりませんが、これは便利だと思いました。

(無題) 削除/引用 No.11159-17 - 2023/02/20 (月) 12:35:18 - おお >タンパク質のありなしだけで比較すると、非特異的にタンパク質がRNAを引っ張ったりする可能性もゼロではないですかね。 最低限RNAが結合しないタンパク質でコントロールをおいてください（GSTとかGFPなど場合によってはBSA）。このコントロールでバンドが現れないような条件を探り、その条件においてあなたのタンパクとの比較をすることで、少なくともコントロールのタンパク質よりはRNAに対してアフィニティーがあると言えます（それが生理的に意味を持つかは置いといて）。その上でそのタンパクのTrancationなどのコンストラクトで探って行けばいいと思います。

(無題) 削除/引用 No.11159-16 - 2023/02/20 (月) 11:17:00 - BAX >[Re:14] 654さんは書きました : > プローブの長さをある程度長くして一つのRNA分子にコンセンサスが現れる確率をあげる（長すぎるとシフト見るのが難しくなるので上限で５０ぐらいかなと言う感覚です）。リコンビナントタンパクを使うのでLysateの検出感度より遥かに高い。ということです。 合理的な説明ありがとうございます。NNNN　50merのRNA合成の際にビオチンかDigを入れておけば、ラベリングの手間も避けられそうですね。これも基本的には、タンパク質のバンドシフトよりもRNAのバンドシフトを観察した方がいいのでしょうね。 タンパク質のありなしだけで比較すると、非特異的にタンパク質がRNAを引っ張ったりする可能性もゼロではないですかね。そうなるとコントロールが難しそうです。あるいはかなり特異度の高い実験なんでしょうかね。　究極的には、RBDを特定して、変異体を作製したりする必要があるのでしょうが。 >そもそもあなたは精製されたリコンビナントタンパクを使うので間接的な結合は見れないはずですよね。 UVを使うのはタンパク同士のクロスリンクがほとんど見られないというメリットを利用しています。 UVを使った方がいいのか、単純なゲルシフトアッセイがいいのか、少し考えたいと思います。リコンビナントタンパク質と、RNAを混ぜてUVを当てたら非特異的な結合も起こる気もしますね。Assayとしては非常に重要な方法だと思いますが。

(無題) 削除/引用 No.11159-15 - 2023/02/20 (月) 09:18:26 - おお >[Re:14] 654さんは書きました : > 御助言いただきありがとうございます。 > 10bpあれば一応結合モチーフを網羅できるのでしょうか。やってみないと分かりませんが、気になったのは、4^10通りの配列となると1つ1つの配列は希釈され過ぎる気もします。 RNA Binding proteinでそんなに長いコンセンサスをもったものは見かけません。私の知っている範囲で長くて８ベースほど、たいてい４から６ベースといったところです。更に制限酵素ほど塩基がきっちり決まらない部分もあります。 希釈に関しては、例えばプローブの長さを５０ベースぐらいにすると４塩基のコンセンサスは５分子に一つの割合で見つかる計算になります。ですからプローブを長めにするとどこかに結合するであろう確率も増えるので検出しやすくなると思います。 また、細胞のLysateを使うゲルシフトではLysateから数マイクログラム程度のタンパク量を取るわけですからその中にある見たいタンパクの量はピコグラムオーダーでしょう。あなたは精製タンパク質を使えるわけでそれを１００ng使ったとしても１０００倍とかの検出感度になるといえます。 まとめるとプローブの長さをある程度長くして一つのRNA分子にコンセンサスが現れる確率をあげる（長すぎるとシフト見るのが難しくなるので上限で５０ぐらいかなと言う感覚です）。リコンビナントタンパクを使うのでLysateの検出感度より遥かに高い。ということです。 > > 間接結合でもRNAが結合する気もするのですが、私の勘違いでしょうか。 そもそもあなたは精製されたリコンビナントタンパクを使うので間接的な結合は見れないはずですよね。 一度オリジナルのペーパーを確認してください。UleさんがNovaというRNA結合タンパク質のターゲットを見つけるとき開発した方法です。 UVを使うのはタンパク同士のクロスリンクがほとんど見られないというメリットを利用しています。Lysis、IPではハッシュなコンディション（ネイティブな条件では一番厳しいRIPA bufferを使っている）でやっています。ターゲットのタンパクとRNAはコバレントに結合しているので一度変性させてタンパクのコンプレックスを乖離させてIPできるコンディションに戻す方法もとれます。DNAをあつかうCHIPでは１％ほどのSDSで熱変性させてからTrion Xを含むバッファーで１０倍希釈しています。類似の方法が取れると思います。 > > 『RNAを抽出して、ウエスタンをする』というのが理解できていないのですが、Trizol等で抽出したら、タンパク質は除外されますよね。どういう方法でしょうか。 非常に短いRNAの結合であればRNAのフラクションに残らないと思いますが、長いRNAであればRNAとして精製可能だと思います。ただし懸念はあると思いますので私はDEAEで精製してエタ沈で回収しています。私のターゲットのタンパクはHis tagがついていたので（細胞内で発現させていた）UVクロスリンク後尿素を使った変性条件でニッケルカラムで粗生成して、それをDEAEにかけていました。 RNAを結合したターゲットの精製の原理はRNAはつよくネガティブにチャージしているので陰イオン交換クロマトでは結合してないターゲットより高い塩濃度で溶出されるというのを利用しています。またエタ沈を使ってますのでRNAが優先して回収されます。ウレア存在下ということも手伝ってタンパクはアルコールでアグる可能性も軽減できています。

(無題) 削除/引用 No.11159-14 - 2023/02/20 (月) 08:05:27 - 654 御助言いただきありがとうございます。 >私もその懸念は書いたのですが工夫によっては可能かもしれません。 ラベルしたランダムな配列のプローブNNNNNNNN(長さは数十ベースぐらいまでである程度長い方が検出しやすいと思います)とかを作れば、ラベルを利用して核酸を検出できます。ラベルはラジオアイソトープとかビオチン、DIGなどが挙げられます。 これは非常に面白いアイデアですね。 10bpあれば一応結合モチーフを網羅できるのでしょうか。やってみないと分かりませんが、気になったのは、4^10通りの配列となると1つ1つの配列は希釈され過ぎる気もします。このあたりは、やってみないとわからないという感じですかね。 >CLIPはタンパクに結合したRNAを検出する方法です。結合を確認するためラジオアイソトープを使ってます。ですから、UVでクロスリンクして、免疫沈降してRNAをラベルしてSDSPAGEをしてラベルしたRNAを検出すれば結合が確認できます。ラベルの仕方はラジオアイソトープがベストですが、ビオチンを数個つけたプライマーをライゲーションするなど工夫はいくらでもできます。 このタンパク質にはRNA結合タンパク質が結合することが分かっていますが、直接RNAが結合するかが、分かっていないため、これを調べたいと思っています。上記の方法ですと、間接結合でもRNAが結合する気もするのですが、私の勘違いでしょうか。 >タンパクは結合するRNAの長さによってシフトするのでSDSPAGEで結合するRNAは従来のタンパクの移動度より遅くなります。ただしWBで検出するとフリーのタンパクが目立ってシフトがわからないでしょう。これを逆手にとって、UVクロスリンク後すぐにRNAを抽出して、ウエスタンで検出するとサイズのシフトしたバンドが検出できる可能性があります。確か私は尿素存在下でDEAEでクロマトをして、RNAがついていると負電荷が増えるので、塩濃度の勾配で溶出して最初に溶出されるフラクションを捨ててそれ以降に溶出してくるタンパクを回収して、RNAをエタチンして、ウエスタンで検出し、シフトを確認した事があります。このシフトはRNaseで解消されました。 『RNAを抽出して、ウエスタンをする』というのが理解できていないのですが、Trizol等で抽出したら、タンパク質は除外されますよね。どういう方法でしょうか。 >少なくともRNAを検出したいのだからRNA検出用蛍光試薬とか使えばどうかとも思いますと言うかそう言う提案もしています。RNA結合タンパクの場合真核生物のものであっても、大腸菌で発現した場合RNAを結合した状態で精製される場合もしばしあります。精製されタンパクをネイティブ電気泳動しRNAを検出すれば結合しているかどうかは明らかになります。 UVでRNAが共有結合していれば、WBでシフトを見たいと思っていましたが、タンパク質の検出はあまり進められないんですかね。 >ビアコア うちの大学には機器がない可能性がありますが、調べたいと思います。

(無題) 削除/引用 No.11159-13 - 2023/02/20 (月) 07:18:01 - おお >[Re:12] 654さんは書きました : > まずゲルシフトアッセイ。 > これはあくまで、ある程度核酸の配列が絞り込めて初めてできる定量的な実験なので、targetの配列が分かっていない段階では、難しいと考えていますが正しいでしょうか。 > 私もその懸念は書いたのですが工夫によっては可能かもしれません。 ラベルしたランダムな配列のプローブNNNNNNNN(長さは数十ベースぐらいまでである程度長い方が検出しやすいと思います)とかを作れば、ラベルを利用して核酸を検出できます。ラベルはラジオアイソトープとかビオチン、DIGなどが挙げられます。 > > これを考えると、RNAをdetectするのではなく、RNAとタンパク質を結合させて、タンパク質を検出する方がベターと愚考しています。 > > そう考えるとCLIPという手法が興味深いのですが、これもWesternでのシフトを見た実験は見つかりません。 CLIPはタンパクに結合したRNAを検出する方法です。結合を確認するためラジオアイソトープを使ってます。ですから、UVでクロスリンクして、免疫沈降してRNAをラベルしてSDSPAGEをしてラベルしたRNAを検出すれば結合が確認できます。ラベルの仕方はラジオアイソトープがベストですが、ビオチンを数個つけたプライマーをライゲーションするなど工夫はいくらでもできます。 タンパクは結合するRNAの長さによってシフトするのでSDSPAGEで結合するRNAは従来のタンパクの移動度より遅くなります。ただしWBで検出するとフリーのタンパクが目立ってシフトがわからないでしょう。これを逆手にとって、UVクロスリンク後すぐにRNAを抽出して、ウエスタンで検出するとサイズのシフトしたバンドが検出できる可能性があります。確か私は尿素存在下でDEAEでクロマトをして、RNAがついていると負電荷が増えるので、塩濃度の勾配で溶出して最初に溶出されるフラクションを捨ててそれ以降に溶出してくるタンパクを回収して、RNAをエタチンして、ウエスタンで検出し、シフトを確認した事があります。このシフトはRNaseで解消されました。 > > total RNAと大腸菌から単離したタンパク質を混ぜて、UVを充てて、Westernで見ればいいのかなとも思ったのですが、これも一般的ではなさそうです。 > 少なくともRNAを検出したいのだからRNA検出用蛍光試薬とか使えばどうかとも思いますと言うかそう言う提案もしています。RNA結合タンパクの場合真核生物のものであっても、大腸菌で発現した場合RNAを結合した状態で精製される場合もしばしあります。精製されタンパクをネイティブ電気泳動しRNAを検出すれば結合しているかどうかは明らかになります。 私は経験がありませんが、タンパクにRNAが飽和させる事が可能であればビアコアが使えると思います。この時精製したタンパクのRNA結合部位が大腸菌由来のRNAにオキュパイされないように気をつける必要がありますねあります。逆にそこそこのながさのランダムな配列なら、短い認識配列なら短いならタンパクが一箇所ぐらいはつく可能性が高いのでそういうRNAをプローブにする事も可能かもしれません。

(無題) 削除/引用 No.11159-12 - 2023/02/20 (月) 06:03:43 - 654 いろいろと調べたのですが、やはり解決できませんので確認も含めて、投稿させていただきます。繰り返しになりますが、あるタンパク質に直接RNAが結合するかを調べたいと考えています。 まずゲルシフトアッセイ。 これはあくまで、ある程度核酸の配列が絞り込めて初めてできる定量的な実験なので、targetの配列が分かっていない段階では、難しいと考えていますが正しいでしょうか。 これを考えると、RNAをdetectするのではなく、RNAとタンパク質を結合させて、タンパク質を検出する方がベターと愚考しています。 そう考えるとCLIPという手法が興味深いのですが、これもWesternでのシフトを見た実験は見つかりません。 total RNAと大腸菌から単離したタンパク質を混ぜて、UVを充てて、Westernで見ればいいのかなとも思ったのですが、これも一般的ではなさそうです。 そうなると、何がベストなのかわからなくなってしまったのですが、再度アドバイスをいただけないでしょうか。

(無題) 削除/引用 No.11159-11 - 2023/02/06 (月) 15:27:02 - おお >[Re:10] 654さんは書きました : > 目的のタンパク質がわかっていて、RNAが結合するのかを調べたいだけの状態です。 > さらに、現在手元にAssayに使うタンパク質を持っているのですが、Helaから抽出したtotal RNAとこのタンパク質を混ぜて、UVを当てるという実験も考えられますかね？ UVクロスリンクの実験ですか？できなくは無いと思います。ただ、r RNAなど大量にあるのでたまたま認識配列ににた配列があると、そう言う大量にあるものばかりが回収されるかもしれません。 > > あるいは仮にバンドがシフトしても、非特異的なRNA-proteinの接触を見ているだけになりますかね。 配列、非依存的なRNA結合タンパク質もあります。結合が非特異的(あーてぃふぁくと)であるかどうかは、ネガコンや結合条件である程度は示すことができます。

(無題) 削除/引用 No.11159-10 - 2023/02/06 (月) 12:52:28 - 654 目的のタンパク質がわかっていて、RNAが結合するのかを調べたいだけの状態です。 さらに、現在手元にAssayに使うタンパク質を持っているのですが、Helaから抽出したtotal RNAとこのタンパク質を混ぜて、UVを当てるという実験も考えられますかね？ あるいは仮にバンドがシフトしても、非特異的なRNA-proteinの接触を見ているだけになりますかね。

(無題) 削除/引用 No.11159-9 - 2023/02/02 (木) 15:02:52 - おお ま、ライブラリー作る技術は大昔からありますから、そのタンパクを回収して、そこに含まれるRNAからライブラリー作り、クローン一つづつでも配列の読んでいけば、ターゲット候補はいくらかみつかります。 特異的な配列はRNAを合成して行ってアフィニティー高そうな物を見つけていけば絞り込みもできます。 あるいはSELEXという方法があります。T7プロモーターの後にプライマー結合配列、ランダムな配列を繋げて、その後にsp6とか上流のプライマーマーとペアで増幅できる配列をつなげたDNAを用意して、T7RNAポリメラーゼでRNAで合成して、精製したターゲットのタンパクをつけたレジンに流し、レジンにとどまるRNAをRTして、もう一度上流にT7プロモーターをつけ、RNAを作り繰り返し、さらに特異的配列をエンリッチしていき、最終的にプラスミドみ入れて、配列を読んで、モチーフを同定するっていう方法。 RIPって言うけど、RNAに結合するかも分からないのにいきなりですかっておもいますし、このメジャーな方法は間接的にRNAにけつごうしていても、RNAが検出できる。 より直接的なら、CLIPっていうほうほうがあって、細胞や組織、ライセートにUVを当て、こばれんとにRNAとタンパクを結合させて、タンパク間結合がなるべく外れるような厳しい条件でIPするか、CHIPのように変性させてから抗体が働くような条件に戻し、IPしてそこからRNAを回収する方法で、考案された当初はRNAseqがなかったか普及してなかったので、得られたRNAはライブラリーにして一つずつクローンの配列を読んでいた。

(無題) 削除/引用 No.11159-8 - 2023/02/02 (木) 14:15:54 - 654 あるタンパク質がRNA結合タンパク質であることを確定させるには、ゲルシフトが一番だけれども、その一方で、ゲルシフトをしようと思うと、RNAの配列の特定が出来ていないといけないというなんだかジレンマのような状態ですね。 いきなりRIP法にジャンプアップをお勧めですかね？ 先達はRIP法なんてなかったにもかかわらず、どうやって大量のRNA配列を特定してきたんですかね。少し文献を見た感じですと、調べたい配列があって、それを元に様々なタンパク質を同定してきたとかそんな感じでしょうかね。

(無題) 削除/引用 No.11159-7 - 2023/02/02 (木) 13:04:39 - toto まだやったことはなくて今やろうかなと思ってるのですが、CRISPR-cas9系を使ってRNAへの結合を調べることが、今は一番簡単そうです。細胞内ですみますし。

(無題) 削除/引用 No.11159-6 - 2023/02/02 (木) 09:12:48 - おお >[Re:4] BlueCommaさんは書きました : > ゲルシフトアッセイがわかりやすいと思います。RNA結合能を見るだけならtotal RNAで反応させればいいのでは？（ゲルシフトやったことがないので不適かもしれませんが・・・） 通常RNAにラベル入れて、シフトが大きくなるように短いRNA（核酸）プローブを使いますからね。あまり長い核酸だと核酸のサイズの位置がタンパクより大きい位置に出てシフトしてんだかしてないんだかという状況になりそう。感触的には１００bでも結構長くてやりにくく感じる。 タンパクを検出するのは、通常の短い核酸でやる分にはタンパクの移動度が大きく変わらない可能性も。 RIが使えるならRIラベルした核酸をクロスリンクしてIPでタンパクを回収してSDSPAGE後にRIを検出するといったてもある。RNAにプルダウンできそうな核酸アナログを取り込ませて、プルダウンしてそのタンパクがあるかどうか確認する手もあると思う。

(無題) 削除/引用 No.11159-5 - 2023/02/02 (木) 00:01:10 - おお リコンビナントで比較的多い量を非変性条件下で出来れば迅速に精製できるなら、精製した物をネイティブの条件で電気泳動して、RNA を蛍光色素で検出するとタンパクとco-migrate していて結合が確認できることがある。人のタンパクを大腸菌で発現したようなばあいでも、まあまあそう言うことはある。

(無題) 削除/引用 No.11159-4 - 2023/02/01 (水) 21:52:41 - BlueComma ゲルシフトアッセイがわかりやすいと思います。RNA結合能を見るだけならtotal RNAで反応させればいいのでは？（ゲルシフトやったことがないので不適かもしれませんが・・・） ターゲットの配列を特定しようとなると，Chip解析が必要なのではないでしょうか？ https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC5697774/#:~:text=The%20RNA%20chromatin%20immunoprecipitation%20assay,of%20the%20RNA%E2%80%93protein%20complexes.

(無題) 削除/引用 No.11159-3 - 2023/02/01 (水) 08:49:43 - 654 ターゲットの配列がよく分からないのですが、こういう場合はどうなるのでしょうか。

(無題) 削除/引用 No.11159-2 - 2023/02/01 (水) 03:46:02 - おお どういう材料があってとか、RNAの配列依存なのかとかいろいろな状況次第でベストな方法がかわるけど、とりあえず一つだけ方法論を書いておきます。 ゲルシフトアッセイ

タンパク質にRNA結合能があるかを調べる方法 削除/引用 No.11159-1 - 2023/02/01 (水) 02:51:56 - 654 タンパク質にRNA結合能があるかを調べています。 in silicoだとソフトが多数あるのですが、どれがベストなのか知識のある方いますか。 in vitroでも様々な実験があるようですが、思ったよりも直接結合しているかどうかを調べるのは簡単ではないようです。どの方法がベストなのか、御存じの方いらっしゃいますか。

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