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(無題) 削除/引用 No.11155-7 - 2023/02/01 (水) 12:49:20 - G25 私はPCR用のDNAを粗抽出するとき、Chelex-100 (Instagene)のスラリーに試料を入れて95-100℃で10-30分くらい処理して上澄みを使うという方法が好きなんです。簡単なのに阻害物資を良く除去してPCRが非常にかかりやすくなる。 しかし硬いmouse tailには無理かなと思って敬遠していました。 でもあらためて調べてみいたら、mouse tailでもいけるという論文が結構ありますね。 例えば、 https://journals.sagepub.com/doi/10.1177/0023677216646088?url_ver=Z39.88-2003&rfr_id=ori:rid:crossref.org&rfr_dat=cr_pub%20%200pubmed

(無題) 削除/引用 No.11155-6 - 2023/02/01 (水) 03:35:58 - おお >[Re:2] おおさんは書きました : > A quick "dirty" prep ... 粗精製でちょっとかかりにくいプライマーセットではうまく行かないこともあるかもしれませんが、Trisで中和したものにグアニジンを加えグラスミルクとかグラスビーズを混ぜると、DNAはビーズにつくのでビーズを沈殿させてアルコールでビーズを洗って水やTEで溶出するというステップをやるとかなり精製度があがる。大抵のキットはグラス（シリカ）を膜状にしてスピンしてサンプルを通して同様のことをやっているけど、自前でビーズを加えるだけで可能なので興味があれば検討するか考えてみてください。 簡単な手順の載ったものが見つからなかったので自身でも調べてみてはどうでしょうか。

(無題) 削除/引用 No.11155-5 - 2023/01/31 (火) 15:29:19 - G25 すでに書き込みがありますが、 NaOHで加熱してlysis、Trisで中和という方法が、 Alkali lysis methodとかHotshot methodとかいう名で普及しています。 マイナーなバリエーションがありますが、総じてlysisの所要時間が10分から1時間くらい。 「mouse tail dna alkali」てなキーワードで検索するといろいろ見つかります。 こちらToyoboの実験例（KOD FXのデモ） ttps://lifescience.toyobo.co.jp/embodiment/detail.php?embodiment_id=40 ttps://lifescience.toyobo.co.jp/embodiment/detail.php?embodiment_id=50 こんなのもあった 爪を直接PCR ttps://lifescience.toyobo.co.jp/embodiment/detail.php?embodiment_id=32

(無題) 削除/引用 No.11155-4 - 2023/01/31 (火) 14:35:39 - まお ＞おおさん ジャクソンのページにこのような記載があったのですね！ ありがとうございます。 早速やってみます。 ＞asanさん 情報ありがとうございます！ おおさんの簡易法が上手くいかなかった場合、トライして みようと思います！ 酵素は自作のものなので、このような場合不安です……。 普段はうまくいっているのですが。

(無題) 削除/引用 No.11155-3 - 2023/01/31 (火) 13:38:25 - asan 自作したものでも数時間ぐらいあるならうまくいくと思いますけど、買うなら以下のものがあります。 https://www.nacalai.co.jp/products/entry/d009002.html カラムなどでもっと簡便に処理できるものもありますが高価ですし、そこまでしなくても大丈夫です。o/nでやっても数時間処理でも通常のジェノタイプぐらいの目的ならできます。 個人的にはどちらかと言うと精製方法よりもどのようなPCR酵素を使うかの方が効率に影響が出ると思います。KODFXなどクルードサンプルからのジェノタイプも効率がいいと主張しているものを使うことがいいと思います。また、ProKを十分熱失活させてない場合はある程度希釈しないと失敗しやすいです。

(無題) 削除/引用 No.11155-2 - 2023/01/31 (火) 13:29:19 - おお https://www.jax.org/jax-mice-and-services/customer-support/technical-support/genotyping-resources/dna-isolation-protocols A quick "dirty" prep is usually sufficient, while some genotyping may work better with highly purified DNA. Determine empirically which protocol works best for your genotyping. NaOH extraction (quick "dirty" DNA preparation). Reference: Truett GE et al. 2000. Biotechniques 29(1):52-54 Cut 2mm of tail and place into an Eppendorf tube or 96-well plate. Add 75ul 25mM NaOH / 0.2 mM EDTA. Place in thermocycler at 98ºC for 1 hour, then reduce the temperature to 15°C until ready to proceed to the next step. Add 75ul of 40 mM Tris HCl (pH 5.5). Centrifuge at 4000rpm for 3 minutes. Take an aliquot for PCR (use 2 ul undiluted, or 2 ul of a 1:100 dilution/reaction).

迅速なgenotyping用DNA抽出 削除/引用 No.11155-1 - 2023/01/31 (火) 12:54:04 - まお お世話になっております。 マウスのしっぽからgenotyping用に迅速な（＝数時間）DNA抽出を行おうと思っています。 良くて安い抽出液か良い方法をご存じの方はいらっしゃいますか？ 今はProtainase Kでo/nで抽出をしているのですが、事情があって、短時間でgenotypingを行いたいためです。 どうぞよろしくお願いします。

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