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(無題) 削除/引用 No.11151-8 - 2023/02/02 (木) 03:05:48 - ASAS > > K0のフェのタイプが明らかでKOされてないコントロールと比較しなくても認識できる場合、KOが手技的にもConsistantでControlと比較でKOを評価する必要がない場合は２者で十分です。ただし念のためKOに対するControlを取っておくというのは図としてもわかりやすくなるので否定するつもりはありません。 示したい事象を考えるとまずはこの組み合わせでやるのが妥当かとおもいました。 > > > まず、最小限どれとどれを比較すれば目的が達成されるのかを考え、実験の性質上その他に見ておく必要があるものはないかで加えていく条件を検討すればいいのではないでしょうか。 たいへん勉強になりました。ご回答くださりありがとうございます。

(無題) 削除/引用 No.11151-7 - 2023/01/31 (火) 02:18:01 - おお 追記 >これですべての条件で同じTransfectionの構成になり、理屈のうえで同じ土台で比較できるということです。 Cas9だけでKDのコントロールとすることを１００％否定はしません。私はXenopusは使ったことがありませんのでその辺を許容範囲とみなせるというコミュニティー内でのコンセンサスがあるとかいう可能性もありますので。

(無題) 削除/引用 No.11151-6 - 2023/01/31 (火) 02:12:20 - おお >この場合は、KD vs KD +強制発現プラスミド　の2群比較でいいという考えでしょうか？ CRISPRによるゲノムEditですからKDではなくKOですよね。 K0のフェのタイプが明らかでKOされてないコントロールと比較しなくても認識できる場合、KOが手技的にもConsistantでControlと比較でKOを評価する必要がない場合は２者で十分です。ただし念のためKOに対するControlを取っておくというのは図としてもわかりやすくなるので否定するつもりはありません。 >ターゲットのないgRNAとGFP発現ベクターとはどのような意味合いでしょうか？ KOのレスキューに必要なのはCas9-gRNAとKOターゲット遺伝子のTet誘導性プラスミド。すべての群でこれを揃えたほうが、プラスミドのある無しが結果に影響することを否定できます。ですから KOはCas9-gRNAとGFPのTet誘導性プラスミド、 KOに対するコントロールはCas9-gRNA用からのベクター（など）とGFPのTet誘導性プラスミド。 これですべての条件で同じTransfectionの構成になり、理屈のうえで同じ土台で比較できるということです。 Tetをすべて加えた条件で比較すればいいといいましがた、＋ーで比較することそんなに変なことではありません。この場合 Cas9-gRNAとKOターゲット遺伝子のTet誘導性プラスミドだけでTetある無しだけですみます（KOが明らかな場合）。Tetの影響を一応見ておいたほうがいいというのであれば、Cas9-gRNAとGFPのTet誘導性プラスミドのTet＋ーか、Cas9-gRNA用からベクターとGFPのTet誘導性プラスミドのTet＋ー加えて４条件の比較でいいと思います。実際色々この系で実験していくならTet誘導性プラスミドのリークなども考慮しないといけないのであればこちらのほうが得られる情報として確実ではあります。 まず、最小限どれとどれを比較すれば目的が達成されるのかを考え、実験の性質上その他に見ておく必要があるものはないかで加えていく条件を検討すればいいのではないでしょうか。

(無題) 削除/引用 No.11151-5 - 2023/01/31 (火) 00:52:14 - ASAS >[Re:3] AAさんは書きました : > たしかにKD実験５回中すべてでフェノタイプがでて有意差もでているのですが、表現系にむらがあるのが懸念点です。 > gRNAはレスキュー用のcDNA配列は認識しないよう、アミノ酸配列は変えずに何箇所か塩基置換をおこなっています。

(無題) 削除/引用 No.11151-4 - 2023/01/31 (火) 00:48:24 - ASAS >[Re:2] おおさんは書きました : > レスキュー > KOされたものと、それに強制発現されたものと2つが有れば示せる。その系でKOされるのが既に示されているなら、この二つで構わないが、KOも毎回行う実験でこの評価も必要ならターゲットのないgRNAとGFP発現ベクターを入れたものが有ればほぼ条件が一緒で比較できる。 > 受精卵にインジェクションしてらF0を使っているのでKDになっていますが、毎回フェノタイプがでることは示されています。 この場合は、KD vs KD +強制発現プラスミド　の2群比較でいいという考えでしょうか？ ターゲットのないgRNAとGFP発現ベクターとはどのような意味合いでしょうか？

(無題) 削除/引用 No.11151-3 - 2023/01/30 (月) 10:51:28 - AA オフターゲット効果についてだけなら繰り返しても必ず同じ結果になる、というだけでもそれなりに認められそうな気はします。 もちろん、PAM遠位の1塩基ミスマッチなどの配列があると毎回同じオフターゲットが生じている可能性もあるので話は変わりますが、基本的にはオフターゲットは試行ごとに異なるパターンで生じると考えて良いと思いますのでreplicateだけでも十分な気がします。 あと本筋から外れるかもしれませんが、今回設計されているgRNAはレスキュー用のcDNA配列は認識しないのでしょうか？あるいはレスキュー用のプラスミドはCas9 mRNAインジェクションから十分に日を空けてから導入されるんでしょうか？ gRNA配列がレスキュー用のcDNAを認識してしまうとレスキュー用の発現プラスミドも消化されると思いますのでそもそもレスキュー実験が成り立たないと思います。

(無題) 削除/引用 No.11151-2 - 2023/01/30 (月) 08:32:53 - おお それぞれの比較にどう言う意味があるのかわかれば方針が立つと思います。 テトラサイクリンの影響 全てのサンプルにテトラサイクリンが入っていれば比較可能。 レスキュー KOされたものと、それに強制発現されたものと2つが有れば示せる。その系でKOされるのが既に示されているなら、この二つで構わないが、KOも毎回行う実験でこの評価も必要ならターゲットのないgRNAとGFP発現ベクターを入れたものが有ればほぼ条件が一緒で比較できる。 テトラサイクリンありなしならGFPのベクターはあまり意味ないと思う。

tet onシステムによるレスキュー実験 削除/引用 No.11151-1 - 2023/01/30 (月) 00:08:55 - ASAS 現在Xenopusを使ってある遺伝子(Aとします）をCRISPR/cas9によりKDした際の表現系を解析しています。 表現系がCRISPRによるオフターゲット効果であるという可能性を否定するためにレスキュー実験を行おうと思っているのですが、そこでコントロールをどのようにおくべきか悩んでいます。 KD実験は、目的遺伝子のgRNAを入れずCas9 mRNAのみを受精卵に注入したものをコントロールとしています。 レスキューは、dox誘導型のtet onシステムを用いた強制発現で行います。 強制発現用のプラスミドには導入確認用にgfpを繋いでいて、その他にplasmid導入のartifactではないことを確認するためのgfp発現plasmidも用意しています。 この時、 �@ [Cas9 dox-]vs [gRNA+A発現plasmid dox-(KD)] vs [gRNA+A発現plasmid dox+(レスキュー)]の3群比較 �A [Cas9 dox+] vs [gRNA +gfp 発現plasmid dox+(KD)] vs [gRNA+A発現plasmid dox+(レスキュー)]の3群比較 �B [Cas9 dox +/- ]vs [gRNA +gfp 発現plasmid dox+/-] vs [gRNA+A発現plasmid dox+/-]　の6群比較 の三通りを考えています。 ラボの先行研究では�Bが推奨されていて、であればdox投与の影響もplasmid導入の考慮してコントロールを設けることができますが、6群比較もする必要があるのでしょうか。 �@or�Aだとコントロールとして弱いでしょうか。それか他に良い比較方法がありますか？ あくまで確認したいのは、KDで出た表現系がA強制発現でレスキューされるかどうかを検証したいということです。 どなたかレスキュー実験のデザインに詳しい方ご教示いただければ幸いです。

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