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(無題) 削除/引用 No.11145-10 - 2023/02/12 (日) 02:14:45 - おお 結果を書き込んでくれて、ありがとうございます。こう言うフィードバックは情報として有用ですから。

(無題) 削除/引用 No.11145-9 - 2023/02/10 (金) 18:33:43 - とり みなさま 複数断片In-Fusionをtryしてみました。結論から言うと6断片まではいけました。 In-Fusion HD(Clontech)ですので、多断片用ではないですが以下の通りです。 元々7断片あって、リコンビナントPCRでうまくくっつけることのできた断片も使って、6, 5断片verを試してみました。一断片当たり、大体1-2kbでtotalで10kb弱のplasmidです。 7断片 0/0 6断片 5/6 5断片 8/8 (32コのコロニー) と言う結果で、まあよかったなという感じです。 当たり前だが、断片がふえるとやはり生える効率は落ちる、でも当たりの確率は問題なさそうです。手が汚い私でもこれなら、まあ上手い人はもうちょいいけるかも？と思います。最高6断片はいけるという認識でいこうと思います。あとはplasmidがワークすることを祈るばかりです。なむなむ。 コメント、suggestionをくださった方々に改めて感謝申し上げます。また宜しくお願いいたします。 とり

みなさま本当にありがとうございました 削除/引用 No.11145-8 - 2023/01/31 (火) 10:05:34 - とり おおさま momoさま totoさま 6fさま 返信遅れて申し訳ありません。曖昧な質問に対して、ご助言と非常に有用な情報ありがとうございました。 多断片In-fusionは効率はやはり落ちるが可能な例があると理解しましたので、7断片クローニングをやりながら、一方でダメだった時ように同時並行で断片数を減らしていくPCRも行い、目的のplasmidを作成を進めていこうと思います。合成DNAもしばらく時間かかるみたいなので、ぼちぼち進めます。 うまくいったときにはまたfeed-backして、ここに情報を残しておこうと思います。 とはいえplasmidを構築する時はなぜか毎度沼にハマるので笑、きっと今回も戦いになると思うのですが、その時はまたご助言賜れますと嬉しいです。 とり

(無題) 削除/引用 No.11145-7 - 2023/01/27 (金) 21:51:11 - 6f マルチクローニング用に改良されたIn-Fusion Snap Assemblyの方を使用してですが、6断片は高効率にアセンブルできました。 僕も当時情報を探しましたが、あまり見つけられませんでした。 プロトコルのどこかに記載があったと思いますが、一部標準から変更してます。 ・各断片のオーバーラップを20bpに ・DNAのモル比を各インサート：ベクター=1:2 6断片は少ししかやっていないので雑感になりますが、 ・効率は落ちるようで、コロニー出現数は標準の2断片クローニングの1/10程度 ・成功率は高く、コロニーPCRでは15/16で目的サイズの増幅を確認 ・2クローンを全長シーケンスしたが変異なし という感じで、問題ない印象です。 以前Takaraの方に何断片まで報告があるか伺いましたが、その場で明確な解答は得られず6断片は多いほうだと思うとだけ言われました。 競合製品のNEBuilderは12断片以上でもアセンブルできると宣伝してますね。 https://www.nebj.jp/f/731 今鞍替えを検討しています。 参考になれば幸いです。

(無題) 削除/引用 No.11145-6 - 2023/01/27 (金) 14:09:58 - toto その場合、連続する３つのフラグメントをまずInFusionかNEBuilderして両端のprimerでPCRして増やし、残りの4つのフラグメントを同じようにして繋いで増やして、その２つの長くなった断片を再度繋いで、大腸菌にいれるというのが、成功率が高いです。４つまではNEBuilderでつないだことあります。

(無題) 削除/引用 No.11145-5 - 2023/01/27 (金) 07:33:17 - momo メーカーの実施例には、4 insert + vectorの5断片の実施例がありますね。

(無題) 削除/引用 No.11145-4 - 2023/01/27 (金) 04:18:28 - おお https://journals.plos.org/plosone/article?id=10.1371/journal.pone.0115318#pone-0115318-g006 キットではないですけど、これは７つ繋げてますね。

(無題) 削除/引用 No.11145-3 - 2023/01/27 (金) 01:16:07 - おお Overlap Extension PCR https://www.snapgene.com/guides/polymerase-chain-reaction 真ん中下よりに解説があります。 やり方にはちょっとしたバリエーションもあるかもしれないのでいろいろプロトコールを見てみるといいかもしれません。 または制限酵素があるところを利用して、LigationしてPCRというのもありえますね。 Overlap Extension PCRで２、３断片にしてからIn-fusionのコンビネーションでもいいかもしれません。

(無題) 削除/引用 No.11145-2 - 2023/01/27 (金) 00:58:24 - おお >断片７つが１つのコンピに入らないといけないから天文学的な数字か？？？ そういうことではないと思います。酵素反応のさいにニックの入った環状のものが出来上がっているから、プラスミドができるのだと思います。確かに全長がうまく繋がったものが反応溶液にある確率はヘルでしょうけど。まあやってみないとわからないですねぇ。 オーバーラップした配列から伸長させながらPCRしていき全長を得るという方法もあり得ると思います。

In-fusionシステムでは、何断片までできるのか？ 削除/引用 No.11145-1 - 2023/01/27 (金) 00:39:29 - とり みなさま、お世話になっております。 件名の通り、やや曖昧なことば恐縮ですが、In-fusionシステム(クロンテック)では、何断片までできるのか？が気になっています。実際に成功した例をお聞きして以下のtrialをやるに値するかを考えたいと思います。 合成で10kbのプラスミドを作ろうとしたのですが(addgeneにはない)、合成不可のところがあって、結局7断片、１断片あたり1-2kbのものをIn fusionでくっつけようと思っています。 原理的にはくっつけるところは大腸菌内で起こると思うので、断片７つが１つのコンピに入らないといけないから天文学的な数字か？？？と感覚的には思っています。自分の経験では3断片までなら全然余裕という感じです。4つ以上は経験ありません。 あまりにも無謀なら、おとなしくリコンビナントPCRでもやって断片の数を減らして、In-fusionをやろうと思います。 情報としてあったら、今後個人的に役に立つなあと思いましたので、質問させていただきました。みなさまからのご意見を頂戴できますと嬉しいです。よろしくお願い申し上げます。

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