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(無題) 削除/引用 No.11142-7 - 2023/01/27 (金) 15:15:15 - kaoru みなさん ありがとうございます。 ひとまずイミダゾール抜いてから-80℃保存するようにしてみようと思います。 沈降したものは塩濃度さらに上げてみたり、Phも変えてみて、溶けるかどうかを試してみようと思います。

(無題) 削除/引用 No.11142-6 - 2023/01/27 (金) 09:38:50 - noname > 逆もあるんですよね。。。。 > たしかに。。。

(無題) 削除/引用 No.11142-5 - 2023/01/26 (木) 22:01:31 - おお >[Re:4] nonameさんは書きました : > イミダゾール存在下で凍結すると析出することはよくあります。 > 私は脱塩カラムなどでイミダゾールを抜いてから凍結します 逆もあるんですよね。。。。

(無題) 削除/引用 No.11142-4 - 2023/01/26 (木) 17:08:57 - noname イミダゾール存在下で凍結すると析出することはよくあります。 私は脱塩カラムなどでイミダゾールを抜いてから凍結します。

(無題) 削除/引用 No.11142-3 - 2023/01/26 (木) 16:37:51 - がぁが 凍結で目的のタンパク質の変性・凝集が起こってしまっていると思うので、-80℃保存をしないわけにはいきませんか？ すぐ2の操作に進む、とか、-80℃ではなく、氷上で数日保管とか。 50%となるようにグリセロールを加えて-20℃（凍結しない）とか、終濃度1M程度のソルビトールを加えて凍結（凝集防止効果）等も考えられますが、その次の硫安による沈殿に影響が出る（沈殿しにくくなる）と思います。 硫安での沈殿は、塩析によるものなので、普通は純水や塩濃度の低い緩衝液によく溶けます。PD10カラムの平衡化に使う溶液でも良いと思います。

(無題) 削除/引用 No.11142-2 - 2023/01/26 (木) 02:35:36 - おお >2で保存後に溶解すると細かい粒状の沈殿と透明な液体に分離される原因は何か考えられますか。対処法ありますか タンパクの構造が不安定であったり、アグリ易い性質を持っていると精製時には溶けていても徐々に沈殿してくることがあります。デタージェントが使えるならいくらか試してもいいかもしれません。あとは弱いカオトロピック作用のあるもの。例えば比較的高い濃度のLiCl（３００mMから１Mとか）。 アルギニンとかはタンパクの安定性に寄与することがあって入れている人もいるようです。その他にもそういったたぐいのものがあるかもしれません（グリセロールとかシュガーとかかな？もっと色々あるかもしれないのでコメントがあるといいですが）。 また、電荷のバランスを変えるためにpHを振るというやり方もあるでしょう。 絶対これでうまくいくというのはないので試行錯誤になるでしょうし、場合によっては徒労に終わる可能性もあるので、溶けないとなると少し頭を抱えることも多いです。

HISタグのリコンビナントタンパク質の精製で沈殿が溶けない 削除/引用 No.11142-1 - 2023/01/26 (木) 00:43:51 - kaoru HISタグのリコンビナントタンパク質を大腸菌で発現後に以下1-5の流れで蛋白精製する予定です。 1ニッケルカラムにイミダゾールを添加して回収 2回収液を―80℃で数日保存(他の実験の都合のため) 3回収液を飽和硫安で再沈殿 4遠心後にペレット（沈殿）を再溶解（30mMTris Ph8.0、100mM-500mMNaClまで塩濃度を検討した） 5PD10カラムで脱塩 しかし、1で回収した液体（クマシでバンドあることは確認済み）は回収時は液体状（リコンビナントタンパク質は溶解できている）でしたが、2で保存後に溶解すると細かい粒状の沈殿と透明な液体に分離されてしまいます。 この液体と細かい沈殿を混合して、3の飽和硫安と混合しても沈殿の量はあまり増えず、その沈殿を4の条件で再溶解しようとしても、細かい粒状の沈殿が残り、PD10カラムで脱塩しても、クマシでまったくバンドは得られませんでした。 質問ですが、 2で保存後に溶解すると細かい粒状の沈殿と透明な液体に分離される原因は何か考えられますか。対処法ありますか（別の蛋白のHISタグのリコンビナントタンパク質の時は―80℃で保存後も細かい粒状の沈殿はできませんでした） またペレットを再溶解（30mMTris Ph8.0、100mM-500mMNaClまで塩濃度変更）しようとしても溶解できなかったため、PD10カラムで引っかかったと思われますが、今回の作るタンパクは論文などでタンパク精製のデータがないタンパクで、正直どのような溶解がいいのかわからない状況です。タンパクの分子量、アミノ酸の配列の情報からどのようなバッファで溶解できるかを調べる方法はありますか。

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